桑叶生物碱对高果糖饮食小鼠糖脂代谢的影响

刘庆普，陈燕，谢彩侠，雷敬卫，冯卫生，郑晓珂*

（1.河南中医药大学药学院，河南 郑州 450046；2.河南省中药质量控制与评价工程技术研究中心，河南 郑州 450046；3.河南省中药开发工程技术研究中心，河南 郑州 450046）

代谢综合征（metabolic syndrome，MS）是多种代谢异常在机体内集结的病理状态，是主要包括肥胖、糖脂代谢紊乱、炎症和高血压等多种危险因素的临床症候群[1-3]。代谢综合征已经成为一个全球性的健康问题，严重威胁着人类的健康，而代谢综合征也是心血管疾病和糖尿病的高危因素[4]。

果糖是一种常见的天然单糖，广泛存在于蜂蜜、水果、谷物及块茎类蔬菜中。随着经济的发展，人们生活方式逐渐改变，含糖饮料等的消费量大幅增长[5]，高果糖玉米糖浆因其价格低廉等优点，大量应用于含糖饮料和食品[6]。人们大量摄入含有高果糖玉米糖浆的食品，导致果糖摄入量增加，而高果糖摄入已经成为代谢综合征的重要病因之一[7-8]。临床上，应用中医药防治代谢综合征具有一定优势，且“药食同源”食物具有天然安全性，因此，从“药食同源”食物中寻找预防和治疗代谢综合征的物质是一条可靠之路。

桑叶为桑科植物桑（Morus alba L.）的干燥叶，桑叶于2002年被卫生部列入《按照传统既是食品又是中药材物质目录》，即“药食同源”。现代研究表明桑叶具有多种药理作用，如降血糖、降血脂、防癌、通便利尿和抗炎等[9-12]。同时，也有越来越多的研究表明桑叶中的生物碱类化合物是桑叶诸多药理作用的关键成分[13]，但关于桑叶生物碱（mulberry leaf alkaloids，MLA）对高果糖饮食所致代谢综合征糖脂代谢紊乱的改善作用尚未见报道。本研究建立了高果糖诱导的代谢综合征小鼠模型，探讨MLA对高果糖代谢综合征小鼠糖脂代谢紊乱的改善作用，为桑叶防治高果糖代谢综合征及相关功能食品的研究与开发提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

SPF级雄性ICR小鼠（60只，体重18 g～22 g）：北京维通利华实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2016～0006，单笼单只喂养，饲养室温度（24±2）℃，湿度约60%，12 h光照/12 h黑暗交替。

果糖（食品级）：山东西王糖业有限公司；盐酸吡格列酮（片）：成都迪康药业有限公司；水合氯醛（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；多聚甲醛固定液（中性）：武汉赛维尔生物科技有限公司；葡萄糖（分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total Cholesterol，TC）、谷丙转氨酶（cereal third transaminase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate transaminase，AST）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒：南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）酶联免疫吸附测定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒：武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；MLA（总生物碱质量分数为80.81%，硅钨酸沉淀法[14]）：河南省中药质量控制与评价工程技术研究中心制备。

1.2 仪器与设备

快速检测血糖仪、血糖试纸：江苏鱼跃医疗设备股份有限公司；iMARK酶标仪：伯乐生命医学产品（上海）有限公司；高速冷冻离心机：德国艾本德公司。

1.3 试验方法

1.3.1 动物试验

雄性ICR小鼠60只，体重18 g～22 g，正常饲养1周后被随机分为 6组（n=10）：正常对照组（NC）给予正常饮食和饮水；模型组（HF）给予正常饮食和30%果糖饮水；MLA低剂量组（MLA-40）给予正常饮食和30%果糖饮水，并灌胃MLA[40 mg/（kg·d）]；MLA中剂量组（MLA-80）给予正常饮食和30%果糖饮水，并灌胃MLA[80 mg/（kg·d）]；MLA高剂量组（MLA-160）给予正常饮食和30%果糖饮水，并灌胃MLA[160 mg/（kg·d）]；吡格列酮组（pioglitazone，Pio）给予正常饮食和30%果糖饮水，并灌胃盐酸吡格列酮[4 mg/（kg·d）]。实验连续进行16周，实验完成后，所有动物禁食12 h，以水合氯醛麻醉，摘眼球取血，在4℃条件下，3 000 r/min离心15 min，取血清用于血清生化指标的检测；迅速解剖取出肝脏，以生理盐水冲洗干净后，取一部分肝脏置于4%多聚甲醛固定液中，用于病理学检测。

1.3.2 口服糖耐量试验

在实验的第16周，动物禁食不禁水12 h，空腹时取尾尖血，用血糖仪测定空腹血糖，记为Glu0′，而后小鼠接受灌胃给予葡萄糖溶液（2 g/kg），在 30、60、90min和120 min测量小鼠血糖，分别记为Glu30′、Glu60′、Glu90′、Glu120′，并计算曲线下面积（area under the cure，AUC）作统计分析，AUC计算公式如下：

1.3.3 血清相关指标检测

小鼠血清中 TG、TC、ALT、AST、SOD 和 MDA 的检测均采用商业试剂盒进行检测，具体实验操作按照说明书进行。

1.3.4 苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，H&E）染色

用于苏木精-伊红染色的肝组织在4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，制成厚度为5 μm的标本，然后用苏木精-伊红试剂进行染色。

1.3.5 炎症因子的检测

TNF-α、IL-1β和IL-6均使用商业ELISA试剂盒测定，具体实验操作按照说明书进行。

1.4 统计学分析

使用GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析。结果以平均值±标准差表示。采用单因素方差分析（oneway ANOVA）评估统计学意义，然后进行Dunnett’s posthoc检验。p＜0.05为显著性差异。

2 结果与分析

2.1 MLA对高果糖代谢综合征小鼠体重的影响

MLA对高果糖代谢综合征小鼠体重的影响如表1所示。

表1 MLA对高果糖代谢综合征小鼠体重的影响（n=10）Table 1 Effect of MLA on body weight of metabolic syndrome mice induced by high fructose（n=10）

与NC组相比，HF组小鼠的体重显著升高（p＜0.05），吡格列酮（Pio）能显著地降低高果糖饮食诱导代谢综合征小鼠的体重（p＜0.05），给予MLA干预后，MLA-40组小鼠的体重与HF组相比无明显变化，MLA-80组小鼠实验结束时体重与HF组相比虽有降低趋势，却无显著性差异（p＞0.05），但其体重增加量与HF组相比有显著性的降低（p＜0.05），而MLA-160组小鼠实验结束时体重和体重增加量与HF组相比有显著性降低。这表明MLA对高果糖喂养导致小鼠体重增加有抑制作用。

2.2 MLA对高果糖代谢综合征小鼠糖代谢的影响

各组小鼠的葡萄糖耐量测试结果见表2。

表2 MLA对高果糖代谢综合征小鼠口服葡萄糖耐量的影响（n=10）Table 2 Effect of MLA on oral glucose tolerance of metabolic syndrome mice induced by high fructose（n=10）

各组小鼠的空腹血糖和葡萄糖耐量曲线下面积测试统计如图1所示。

图1 MLA对高果糖代谢综合征小鼠空腹血糖和葡萄糖耐量曲线下面积的影响（n=10）Fig.1 Effect of MLA on fasting blood-glucose and area under the oral glucose tolerance curve of metabolic syndrome mice induced by high fructose（n=10）

由图1可知，经过16周高果糖喂养后，HF组小鼠空腹血糖与NC组相比有升高趋势，无显著性差异，但其葡萄糖耐量曲线下面积高度显著升高（p＜0.001），说明HF组小鼠对葡萄糖的耐受能力出现了明显的下降。经过MLA的干预后，小鼠的空腹血糖与HF组相比有降低趋势，但无显著性差异；然而，与HF组相比，MLA三个剂量干预的小鼠葡萄糖耐量曲线下面积均高度显著降低（p＜0.001），说明小鼠的葡萄糖的耐受能力明显提升。这表明MLA可以改善高果糖饮食导致的小鼠糖代谢紊乱。

2.3 MLA对高果糖代谢综合征小鼠血脂影响

MLA对高果糖代谢综合征小鼠血脂影响如图2所示。

由图2可知，HF组小鼠的TG和TC水平与NC组相比高度显著升高（p＜0.001），说明高果糖喂养的小鼠出现血脂异常，脂代谢紊乱；经过MLA干预后，MLA三个剂量均可显著降低高果糖喂养小鼠的TG水平，MLA-80、MLA-160可以显著降低血清TC水平，MLA-40的血清TC水平与HF组相比虽无显著性差异，但也有降低的趋势。这表明MLA可以改善长期高果糖喂养小鼠的血脂异常。

图2 MLA对高果糖代谢综合征小鼠血脂的影响（n=10）Fig.2 Effect of MLA on blood lipid of metabolic syndrome mice induced by high fructose（n=10）

2.4 MLA对高果糖代谢综合征小鼠肝功能的影响

为探讨MLA对高果糖饮食诱导的代谢综合征小鼠肝功能的影响，实验检测了小鼠的血清AST和ALT，结果如图3所示。

由图3可知，与NC组小鼠相比，HF组小鼠经过16周的高果糖饮食后血清中的AST和ALT均高度显著升高，表明高果糖饮食已经导致小鼠的肝功能受损；MLA-80、MLA-160均可有效地阻止血清AST和ALT的升高，MLA-40组小鼠的血清AST和ALT水平与HF组相比虽无显著性差异，但也有一定的降低趋势。这表明MLA能够改善高果糖饮食导致的肝功能损伤。

图3 MLA对高果糖代谢综合征小鼠肝功能的影响（n=10）Fig.3 Effect of MLA on liver function of metabolic syndrome mice induced by high fructose（n=10）

2.5 MLA对高果糖代谢综合征小鼠肝脏组织病理形态的影响

MLA对高果糖代谢综合征小鼠肝脏组织病理形态（H&E）的影响如图4所示。

图4 MLA对高果糖代谢综合征小鼠肝脏组织病理形态（H&E）的影响Fig.4 Effect of MLA on pathological morphology of liver tissue of metabolic syndrome mice induced by high fructose

由图4可知，对各组小鼠进行H&E染色分析，结果显示，NC组小鼠肝组织静脉分布均匀，周围肝细胞排列整齐紧密，呈放射状，未见空泡。经过16周高果糖饮食后，HF组小鼠的肝脏细胞明显肿胀，静脉周围细胞排列较乱，并有大量的空泡形成，这表明高果糖饮食损伤了小鼠的肝脏组织结构，给予MLA干预后，MLA-40组小鼠肝脏组织结构仍然存在明显损伤；MLA-80组小鼠肝脏组织结构可见少量损伤，相比于HF组明显减少；MLA-160组小鼠肝脏组织结构中几乎看不到损伤。这表明MLA对高果糖饮食小鼠肝脏的组织结构具有保护作用。

2.6 MLA对高果糖代谢综合征小鼠血清中SOD和MDA的影响

MLA对高果糖代谢综合征小鼠血清中SOD和MDA的影响如图5所示。

图5 MLA对高果糖代谢综合征小鼠血清SOD和MDA的影响（n=10）Fig.5 Effect of MLA on serum SOD and MDA of metabolic syndrome mice induced by high fructose（n=10）

由图5可知，HF组血清中SOD的活力相较于NC组出现高度显著性下降（p＜0.001），经过MLA的干预后，三个剂量组小鼠的血清SOD活力均有高度显著回升（p＜0.001）；与NC组相比，HF组小鼠的血清MDA水平高度显著升高（p＜0.001），经过MLA的干预后，MLA-80、MLA-160组小鼠的血清MDA水平与HF组相比极显著降低（p＜0.001），MLA-40组与HF组相比虽无显著性差异，但也有一定的下降趋势。这表明长期高果糖饮食小鼠抗氧化能力下降，而MLA可以提高长期高果糖饮食小鼠的抗氧化能力。

2.7 MLA对高果糖代谢综合征小鼠炎症因子的影响

为进一步探索MLA改善高果糖代谢综合征小鼠糖脂代谢的作用，实验采用ELISA法测定了各组小鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，结果如图6所示。

图6 MLA对高果糖代谢综合征小鼠血清炎症因子水平的影响（n=10）Fig.6 Effect of MLA on serum inflammatory factors of metabolic syndrome mice induced by high fructose（n=10）

图6结果显示，与NC组相比，HF组小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6的含量均显著性升高（TNF-α：p＜0.001；IL-1β：p＜0.001；IL-6：p＜0.01）；与 HF 组相比，MLA-80组和MLA-160组小鼠血清TNF-α水平均有显著性降低 （MLA-80：p＜0.05；MLA-160：p＜0.01），MLA-40组血清TNF-α水平虽无显著性差异，但有一定的降低趋势；与HF组相比，MLA-80组和MLA-160组小鼠血清IL-1β水平均有显著性降低（MLA-80：p＜0.01；MLA-160：p＜0.001），MLA-40 组小鼠血清 IL-1β水平虽无显著性差异，但有一定的降低趋势。与HF组相比，MLA-80组和MLA-160组小鼠血清IL-6水平均有显著性降低（MLA-80：p＜0.05；MLA-160：p＜0.01），MLA-40组血清IL-6水平虽无显著性差异，但有一定的降低趋势。以上结果表明MLA可以减轻高果糖饮食小鼠的炎症反应。

3 讨论与结论

在本研究中，高果糖喂养16周的小鼠空腹血糖与正常组相比虽无显著性差异，但其葡萄糖耐量已明显受损，这表明高果糖饮食导致了小鼠的糖代谢异常。经过MLA的干预后，小鼠葡萄糖耐量明显改善，这表明MLA可以改善高果糖代谢综合征小鼠的糖代谢紊乱。同时，高果糖饮食使小鼠的体重明显增加，血清TC、TG水平显著升高，说明高果糖饮食的小鼠脂代谢也出现异常。长期的脂代谢异常可导致肝组织受损，AST和ALT就会被释放进入血液，导致血液中AST和ALT水平升高[15]，在本研究中，高果糖饮食小鼠血清AST和ALT水平明显升高，这说明其肝脏已经受到损伤，进一步的病理结果分析显示高果糖饮食的小鼠肝脏结构出现损伤，这些结果证明了长期高果糖饮食可以损伤小鼠的肝脏。而MLA干预后，高果糖饮食小鼠的体重增长受到明显的抑制，TC、TG水平显著降低，这说明MLA具有改善高果糖饮食小鼠脂代谢异常的作用，同时，经MLA干预后，血清AST和ALT水平明显降低，肝脏的结构病变得到明显改善，这些结果证实MLA对肝脏有一定的保护作用。

在肥胖和糖脂代谢紊乱的情况下，体内氧化与抗氧化作用失衡，引起氧化应激，产生大量氧化中间产物，诱使各种细胞因子释放，从而引起机体的损伤[16]。大量研究表明肝组织的损伤与氧化应激密切相关[17-18]，高果糖饮食引起肝损伤的机制与果糖可导致氧化应激损伤有关[19-20]，SOD和MDA是反映机体氧化应激状态的重要指标[21]，在本研究中，小鼠经16周高果糖的喂养后，MDA水平明显升高，抗氧化酶SOD水平显著降低，这表明小鼠的抗氧化能力下降且氧化应激增强。而MLA可以降低MDA水平，同时升高抗氧化酶SOD水平。这些结果表明MLA的肝脏保护作用与其能够提升机体的抗氧化能力，改善高果糖饮食导致的氧化应激有关。

TNF-α、IL-6和IL-1β是由多种炎症细胞分泌的炎症因子，有研究证实过量摄入果糖可导致体内炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平升高[22]，在本研究中，小鼠经16周高果糖喂养后，血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平出现了显著性升高，这与既往的研究相符[22]，而MLA的干预可以抑制高果糖饮食导致的TNF-α、IL-6和IL-1β水平升高，表明MLA能够减轻高果糖饮食导致的炎症反应。TNF-α、IL-6和IL-1β与糖代谢和脂代谢密切相关，研究表明降低血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平可以改善糖代谢和脂代谢[23-25]。这些结果表明MLA改善高果糖代谢综合征小鼠糖脂代谢紊乱可能与其能降低血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平减轻炎症反应有关。

综上所述，本研究证实了桑叶生物碱可以改善高果糖代谢综合征小鼠的糖脂代谢紊乱，保护肝脏，其作用可能与改善机体氧化应激和减轻炎症反应有关。桑叶被广泛用作功能性或医用添加剂，本研究可为桑叶防治果糖代谢综合征及相关功能食品的研究与开发提供试验依据。