基于BP神经网络-遗传算法和信息熵理论优化凉粉草煎煮提取工艺

谢平 ，魏海峰 ，温仁华 ，沈金海 ，郝春莉 ，陈良华

1.厦门华厦学院环境与公共健康学院，福建 厦门 361024；2.生化制药福建省高校工程研究中心，福建 厦门 361024；3.厦门市食品药品安全重点实验室，福建 厦门 361024；4.福建省亚热带植物研究所，福建 厦门 361006

凉粉草Benth.为唇形科凉粉草属多年生草本植物，性凉，味甘淡涩，嚼之有胶性，可治中暑、糖尿病、高血压、急性肾炎、牙痛、关节疼痛及黄疸等。研究表明，凉粉草富含多糖、黄酮、酚类及萜类等成分，具有抗氧化、降血压、降血脂、降血糖及抗菌等药理作用。凉粉草在福建各地种植历史悠久，武平、建瓯等地有 70多年的栽培历史，属传统主产区，资源丰富，价格低廉，具有长期食用、炮制配伍的历史，具有广阔的产品开发利用前景。

在提取工艺优化过程中，为弥补多指标成分优化在确定权重系数时主观赋值的不足，引入信息熵理论，可使权重系数的确定更具客观性，某个属性变异程度越大，系统越有序，则其权重系数越大。构建BP神经网络，模拟生物神经结构，可在不知晓具体数学模型的情况下，通过自学与训练解决实际问题。结合遗传算法，模仿自然界生物进化思想进行全局寻优，可解决BP神经网络收敛速度慢、容易陷入局部最小值的问题。

本研究以咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸、丹酚酸B、总黄酮含量及干膏收率为评价指标，采用L（3）正交试验，结合信息熵理论确定权重系数计算综合评分，并将数据用于训练BP神经网络，通过遗传算法进行寻优，并与正交试验结果比较，验证其可行性，以提高工艺优化的客观性，从而优化凉粉草的煎煮提取工艺，为其进一步开发利用提供参考。

1 仪器与试药

UV-2450型紫外可见分光光度计（日本岛津公司），LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津公司），XS205十万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），ME55/02万分之一电子天平（赛多利斯上海有限公司），JB/T5374-1991电子天平（奥豪斯国际贸易上海有限公司），CT15RT型台式高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂），KQ-500E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

凉粉草药材，产地福建龙岩武平，经厦门华厦学院环境与公共健康学院赖源发副教授鉴定为唇形科植物凉粉草Benth.的干燥全草。迷迭香酸对照品（批号RP180607，纯度≥98%），成都麦德生科技有限公司；咖啡酸对照品（批号D18121724，纯度≥98%）、紫草酸对照品（批号D19041017，纯度≥98%）、紫云英苷对照品（批号 D19012403，纯度≥98%），南京狄尔格医药科技有限公司；芦丁对照品（批号 JZ15052601，纯度≥98%），南京景竹生物科技有限公司。甲醇、乙腈为色谱纯，亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 干膏收率测定

精密量取煎煮提取液25 mL，置已恒定质量（M）的蒸发皿中，于105 ℃干燥至恒重，置于干燥器中冷却30 min，精密称定质量（M），计算干膏收率。干膏收率（%）＝（M－M）/m×100%，式中，m为待测样品中药材总质量。

2.2 总黄酮含量测定

2.2.1 对照品溶液制备

精密称取芦丁对照品适量，加甲醇溶解，制成浓度为0.206 0 mg/mL的对照品溶液，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液制备

精密称取凉粉草药材约20 g，加一定倍数水，浸泡0.5 h，根据试验安排进行煎煮，四层滤布趁热过滤，合并，得凉粉草煎煮提取液，浓缩，放置室温，置于100 mL量瓶中，定容，摇匀，精密吸取2.0 mL，置于10 mL量瓶中，20%乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，4 000 r/min离心10 min，取上清液，即得。

2.2.3 显色方法及测定波长选择

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各1.0 mL，置25 mL量瓶中，精密加入7.5%亚硝酸钠溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，精密加入7.5%硝酸铝溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，精密加入4%氢氧化钠溶液10.0 mL，加水稀释至刻度，摇匀，放置10 min，以缺供试品的显色体系为空白，于200～800 nm波长范围扫描。结果表明，对照品溶液及供试品溶液均在500 nm波长处有最大吸收峰，故确定测定波长为500 nm。

2.2.4 线性关系考察

分别精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、8.0 mL，置25 mL量瓶中，按“2.2.3”项下方法操作，以空白的显色体系为参比，在500 nm波长处测定吸光度，以浓度 C（μg/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。结果芦丁的回归方程为＝1.18×10－1.43×10（＝0.999 6），表明在8.24～65.92 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度试验

取“2.2.1”项下对照品溶液3.0 mL，按“2.2.3”项下方法操作，于500 nm波长处重复测定6次吸光度并计算RSD，结果吸光度RSD＝0.24%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液3.0 mL，按“2.2.3”项下方法操作，分别于室温放置0、5、10、15、20、25、30 min，于500 nm波长处测定吸光度，结果吸光度RSD＝2.48%，表明供试品溶液在显色后30 min内稳定。

2.2.7 重复性试验

取药材约20 g，共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.3”项下方法操作，于500 nm波长处测定吸光度并计算样品中芦丁的含量，结果总黄酮的平均含量为 28.23 mg/g，RSD＝2.53%，表明方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验

分别精密量取已知含量的煎煮汤剂1.0 mL，分别精密加入芦丁对照品适量，按“2.2.2”项下方法制备，按“2.2.3”项下方法操作，于500 nm波长处测定吸光度并计算加样回收率，结果平均回收率为 98.21%（RSD＝2.43%），表明方法准确度良好，见表1。

表1 总黄酮加样回收率试验结果

2.3 咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸、丹酚酸 B含量测定

2.3.1 混合对照品溶液制备

精密称取咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸、丹酚酸B对照品适量，加甲醇溶解，制成浓度分别为咖啡酸0.104 mg/mL、紫云英苷 0.118 mg/mL、迷迭香酸0.120 mg/mL、丹酚酸B 0.096 mg/mL的混合对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液制备

同“2.2.2”项下方法。

2.3.3 阴性对照溶液制备

同“2.2.3”项下方法。

2.3.4 色谱条件与系统适用性试验

采用中谱红RD-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～9.5 min，18%A；9.5～18.5 min，18%A→19%A；18.5～20 min，19%A→20%A；20～25 min，20%→22%A；25～35 min，22%A→24%A；35～42 min，24%A→30%A；42～50 min，30%A→18%A），流速1.0 mL/min，检测波长320 nm，柱温25 ℃，进样量10 μL。在上述色谱条件下，各色谱峰分离效果良好，R＞1.5。

2.3.5 专属性试验

分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪进行测定。结果表明，色谱峰分离良好，阴性对照无干扰。色谱图见图1。

图1 凉粉草煎煮液HPLC图

2.3.6 线性关系考察

精密量取“2.3.1”项下混合对照品溶液0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL，分别置10 mL量瓶中，20%乙腈稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取系列对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪中，以浓度（μg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，绘制标准曲线，结果见表2。

表2 4种成分线性关系考察结果

2.3.7 精密度试验

取“2.3.1”项下混合对照品溶液1.0 mL，置10 mL量瓶中，20%乙腈稀释至刻度，摇匀，按“2.3.4”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积，结果咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸、丹酚酸B峰面积的RSD分别为 0.59%、1.28%、1.29%、2.88%，表明仪器精密度良好。

2.3.8 稳定性试验

取“2.3.2”项下供试品溶液，分别于室温下放置0、2、4、6、8、12 h，按“2.3.4”项下色谱条件测定，记录峰面积，结果咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸、丹酚酸B峰面积的RSD分别为0.23%、2.01%、2.64%、2.58%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.3.9 重复性试验

称取凉粉草药材20 g，共6份，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.4”项下色谱条件测定并计算含量，结果咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸、丹酚酸B平均含量为0.11、0.07、0.16、0.12 mg/g，RSD分别为 2.54%、2.32%、2.32%、2.50%，表明该方法重复性良好。

2.3.10 加样回收率试验

分别精密量取已知含量的凉粉草煎煮汤剂1.0 mL，分别精密加入混合对照品溶液，按“2.3.2”项下方法制备并按“2.3.4”项下色谱条件测定，计算咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸、丹酚酸 B的回收率及RSD，结果见表3，表明该方法准确性良好。

表3 4种成分加样回收率试验结果

2.4 提取工艺单因素考察

采用煎煮提取方法，以干膏收率、总黄酮含量、咖啡酸含量、紫云英苷含量、迷迭香酸含量及丹酚酸B含量为指标，进行单因素考察。

2.4.1 煎煮时间

称取凉粉草药材约20 g，加入16倍量水，浸泡0.5 h，提取2次，每次分别提取0.5、1.0、1.5、2.0 h，取煎煮提取液，按“2.1”“2.2”“2.3”项下方法测定各指标。结果表明，随着煎煮时间的延长，提取液中各指标含量逐渐上升，煎煮时间为2.0 h与1.5 h比较无明显变化，故选择煎煮时间为0.5、1.0、1.5 h进行后续研究。

2.4.2 加水倍数

称取凉粉草药材约20 g，分别加入10、12、14、16、18、20倍量的水，提取2次，每次提取1.5 h。取煎煮提取液，按“2.1”“2.2”“2.3”项下方法测定各指标。结果表明，随着加水倍数的增加，提取液中各指标含量逐渐上升，加 18、20倍量水提取的各指标差异不大，故选择加水倍数为 14、16、18倍进行后续研究。

2.4.3 提取次数

称取凉粉草药材约20 g，分别加入16倍量水，单次提取时间为1.5 h，分别提取1、2、3、4次，取煎煮提取液，按“2.1”“2.2”“2.3”项下方法测定各指标。结果表明，随着提取次数的增加，提取液中各指标含量逐渐上升，提取3、4次后各指标差异不大，故选择提取次数为1、2、3次进行后续研究。

2.5 提取工艺正交试验

基于单因素考察结果，确定药材浸泡时间为30 min；选择加水倍数（A）、煎煮时间（B）、提取次数（C）为考察因素，以4种指标成分含量、总黄酮含量及干膏收率为综合得分指标，建立三因素三水平正交试验设计，采用L（3）正交试验，因素水平见表4。按“2.2.2”项下方法制备9份供试品溶液，测定各指标，结果见表5，方差分析见表6。

表4 凉粉草煎煮提取工艺正交试验因素水平

表5 凉粉草煎煮提取工艺L9（34）正交试验结果

表6 凉粉草煎煮提取工艺正交试验结果方差分析

由方差分析结果可知，各因素对综合指标的影响顺序为 C＞B＞A，即提取次数＞煎煮时间＞加水倍数，其中因素B、C有显著影响（＜0.05）。正交试验最佳工艺为ABC，即加16倍量水，煎煮3次，每次1.5 h。

2.6 基于信息熵赋权

计算得H＝[0.990 2，0.982 4，0.987 4，0.990 7，0.988 7，0.991 0]，W＝[0.090 6，0.163 5，0.451 7，0.105 7，0.105 0，0.083 5]，即总黄酮、咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸、丹酚酸B含量及干膏收率权重系数依次为 0.090 6、0.163 5、0.451 7、0.105 7、0.105 0、0.083 5，则＝（X/X×0.090 6＋X/×0.163 5＋/×0.451 7＋/×0.105 7＋丹酚酸B/丹酚酸B×0.105 0＋/×0.083 5）。

2.7 BP神经网络与遗传算法优选

2.7.1 神经网络建模

采用Matlab R2018b软件进行BP神经网络模型建模及遗传算法寻优。以影响提取工艺的3个条件为输入变量，各指标赋权后计算得到的综合得分作为输出变量，在每组数据基础上增加△±i值（i＝±0.1%），使L（3）正交试验每组数据产生8个虚拟样本，增加训练空间内的样本密度。

当隐层节点数为 7时，训练数据平均绝对误差（MAE）、测试数据平均绝对误差（MAE）、数据整体均方误差（MSE）最小，见表7。最终确定为3个输入层、1个输出层、7个隐藏层节点的遗传神经网络模型，设定BP神经网络训练循环次数为1 000，学习速率为默认值0.01，训练误差目标为0.000 01，对神经网络进行训练。

表7 凉粉草煎煮提取工艺BP神经网络模型神经元数目优化

为了检验模型的准确性，将检验样本的自变量输入模型，经模型预测，得到预测值，将预测值与实际值进行比较，结果见图2。预测值与实际值间误差很小（正负误差在1.0%以内），吻合度很高，表明所建立的BP神经网络模型稳定且泛化能力强，可用于估算不同提取条件下的凉粉草提取效果。

图2 凉粉草提取工艺BP神经网络模型可靠性验证试验

2.7.2 遗传算法寻优

初始化神经网络，对输入数据进行训练，运用适应度函数，模拟生物遗传过程，通过选择、交叉和变异3个步骤形成新群体并筛选出优秀的个体，当个体的适应度趋于收敛，达到最优状态。

遗传算法中设置的参数为迭代进化次数 1 000次，种群规模10，交叉概率0.8，变异概率0.2，得到适应度曲线，见图3。随着迭代次数增加，适应度曲线逐渐上升并逐渐成一条直线时，表明该种群已达到最优状态，适应度较高的个体竞争胜出。可以看出，经300次迭代后达到最佳适应度，综合得分的预测最大值为93.753 1，最佳提取工艺为加17.037 5倍量水、提取时间1.497 8 h、提取2.999 4次。

图3 凉粉草提取工艺遗传算法适应度曲线

2.8 提取工艺验证

分别称取3批凉粉草药材各500 g，按正交试验及BP神经网络-遗传算法优选得到的最佳提取工艺进行验证试验，结果RSD＜5%，综合得分稳定，见表8。表明优化得到的工艺可行性较高，可用于工业化生产。

表8 凉粉草提取工艺验证试验结果（n＝3）

3 讨论

凉粉草体积较大，吸水较多，故以吸水率为指标，单独考察浸泡时间。精密称取凉粉草药材25 g，共8份，分别加水500 mL，浸没药材，密封，室温放置，分别于10、20、30、40、50、60、90 min取样，用四层纱布过滤，拧干，测定滤出水量，计算各时间点的吸水率。结果表明，凉粉草浸泡0.5 h后，吸水率已无明显变化，基本达到饱和，故确定浸泡时间为0.5 h。

本试验比较了流动相分别为甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.2%甲酸水溶液和甲醇-0.1%磷酸水溶液的等度洗脱及不同比例梯度洗脱程序，结果表明，以甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相梯度洗脱时，凉粉草中各成分的色谱峰分离效果良好且基线平稳。

通过 HPLC-PDA分析，比较色谱图，结果在波长320 nm处，凉粉草药材中咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸及丹酚酸 B的色谱峰峰面积最大，且基线平稳，故选择检测波长为320 nm。

中药材含诸多有效成分，采用单一评价指标难以科学评价提取工艺，因此，本研究选择多指标评价体系对凉粉草煎煮提取工艺进行优选。在多指标评价体系中，各指标的权重分配显得尤其重要。与BP神经网络结合遗传算法等相关研究比较，本研究引入信息熵理论，通过信息熵处理复杂多量数据，对权重系数进行客观赋权。权重系数完全来自正交试验所得多指标数据，反映了指标成分在不同煎煮提取条件下变化的客观规律，避免了数据间的相互影响，减少主观因素对试验结果的干扰。

采用正交试验，只能在已知的水平下对凉粉草煎煮提取工艺进行优化，不具有全局性，且提取工艺属于多维非线性系统优化问题，无明确数学模型；运用BP神经网络建立黑箱模型，弥补了正交试验优化在非线性关系中的不足，在构建BP神经网络的同时，引入 MAE、MAE、MSE及决定系数用于确定神经元的数目，避免神经元数目较多时可能出现过度拟合的情况；同时结合遗传算法迭代进化，直至个体适应度达到最佳状态，进行寻优，使其成为一种全局优选的算法。

本研究在单因素试验基础上，基于信息熵理论确定各指标权重系数，计算综合得分，采用正交试验并建立结构为3-7-1的三层BP人工神经网络，结合遗传算法进行寻优，显示该模型的可靠性，且能有效预测凉粉草的最佳煎煮提取工艺。验证试验结果表明，优化所得的提取工艺重复性好、稳定性高，可用于煎煮提取工艺的优化。