降尿酸方对高尿酸血症大鼠肾损伤及肾组织EZH2表达的影响

周嘉宝，刘秋玉，王传旭，陆黎黎，徐黎，高建东

上海中医药大学附属曙光医院，上海中医药大学中医肾病研究所，上海中医药大学肝肾疾病病证教育部重点实验室，上海市中医临床重点实验室，上海 201203

高尿酸血症是由血尿酸（SUA）生成增加或排泄减少引起的代谢性疾病。SUA稳态改变与肾损伤密切相关。研究表明，治疗高尿酸血症可延缓慢性肾脏病（CKD）的进展。高水平尿酸使肾脏抗凋亡和促凋亡蛋白表达失衡，释放趋化因子和细胞因子，引起慢性炎症和肾纤维化，最终导致肾功能衰竭。目前，临床常用降尿酸药物如别嘌醇、非布司他等被作为肾脏保护剂，但其引起的过敏、心血管风险等不良反应不可忽视。

表观遗传修饰主要包括DNA的共价修饰和组蛋白的翻译后修饰，与肾脏疾病发生发展密切相关。Zeste基因增强子人类同源物2（EZH2）是一种组蛋白甲基转移酶，通过催化组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化（H3K27me3），抑制靶基因转录。研究发现，EZH2和H3K27me3在体外培养的肾成纤维细胞、单侧输尿管结扎小鼠和CKD患者肾组织中高表达，抑制EZH2可阻断高尿酸血症小鼠肾组织H3K27me3和Cleaved Caspase-3表达，还可降低SUA，减轻肾损伤和纤维化。

降尿酸方是上海中医药大学附属曙光医院肾病科根据“活血通络、化痰降浊”治法总结创立的经验方，该方在减轻尿酸性肾病患者腰酸乏力等不适症状、降低血尿酸、抑制肾纤维化、保护肾功能等方面有一定作用，但具体作用机制尚不清楚。因此，本研究通过制备高尿酸血症大鼠模型，观察降尿酸方对高尿酸血症大鼠肾损伤及组蛋白甲基转移酶EZH2表达的影响，为高尿酸血症及其肾损伤的中医药治疗提供依据。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠40只，8周龄，体质量180～220 g，上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，动物许可证号SYXK（沪）2018-0016。饲养于上海中医药大学实验动物中心室温25 ℃、相对湿度45%环境，自由摄食饮水，适应性喂养1周。本实验经上海中医药大学伦理委员会审批（SZY201604006）。

1.2 药物

降尿酸方（酒大黄10 g，粉萆薢10 g，炒王不留行10 g，威灵仙15 g，盐车前子15 g，炒芥子10 g，山楂10 g），免煎颗粒购自江阴天江药业有限公司，蒸馏水加热溶解，制成浓度为1.6 g/mL药液。别嘌醇缓释胶囊，规格0.25 g/粒，黑龙江澳利达奈德制药有限公司，批号18030901，取内容物，蒸馏水溶解，制成浓度为2.5 mg/mL药液。

1.3 主要试剂与仪器

氧嗪酸钾，山东中科泰斗有限公司，批号080601；羧甲基纤维素钠（CMC-Na），上海麦克林生化科技有限公司，批号C10097951；Cleaved Caspase-3抗体，美国CST公司，货号9661S；Bax抗体，英国Abcam公司，货号ab182733；Bcl-2抗体，美国ABclonal公司，货号A0208；GAPDH抗体，美国Proteintech公司，货号60004-1-Ig；EZH2抗体，美国CST公司，货号5246；H3K27me3抗体，美国CST公司，货号9733；Ⅰ型胶原蛋白（ColⅠ）抗体，美国Affinity公司，货号AF7001；Ⅳ型胶原蛋白（ColⅣ）抗体，美国Affinity公司，货号AF0510；HRP标记山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG，上海碧云天生物技术有限公司，货号分别为A0216、A0208；细胞凋亡试剂盒，瑞士Roche公司，货号11684817910；PVDF膜，美国 Millipore公司，货号 IPVH00005。离心机（美国Beckman公司，型号Avanti J-E），电泳及转膜电源仪（美国 Bio-Rad公司），凝胶成像系统（上海天能科技有限公司，型号 Tanon-5200），生物组织冷冻包埋机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，型号KD-BM），摊片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，型号KD-P），烘片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，型号KD-H）。

2 实验方法

2.1 分组、造模及给药

40只大鼠随机分为正常组、模型组、降尿酸方组和别嘌醇组，每组10只。实验第1日起，除正常组外，其余各组大鼠予氧嗪酸钾溶液 1 500 mg/kg灌胃，6 h后降尿酸方组和别嘌醇组分别按16 g/kg、25 mg/kg予降尿酸方和别嘌醇灌胃（相当于60 kg成人临床用药量6倍），给药体积10 mL/kg，正常组和模型组予生理盐水灌胃，每日1次，连续12周。

2.2 样本收集

给药结束后，使用代谢笼收集大鼠24 h尿液检测24 h尿蛋白（UTP），目内眦采血检测大鼠血肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）、SUA，样品送至上海中医药大学附属曙光医院检验科检测。2.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，摘取双侧肾脏，分别进行病理观察、免疫组化染色和Western blot检测。

2.3 病理观察

取大鼠肾组织，90%乙醇固定24 h，梯度乙醇脱水，浸蜡、石蜡包埋、切片（3 μm），脱蜡后行HE、Masson染色，中性树脂封片，光镜下观察大鼠肾组织病理形态。

2.4 细胞凋亡检测

肾组织石蜡切片脱蜡至水，加入 Proteinase K，室温孵育30 min，TUNEL染色，滴加converter-POD，室温避光孵育30 min，DAB显色，苏木素复染，中性树脂封片，光镜下观察细胞凋亡情况，以细胞核黄褐色为阳性结果。

2.5 免疫组化染色

肾组织石蜡切片脱蜡至水，抗原修复，3%BSA室温封闭30 min，加入ColⅠ（1∶50）、ColⅣ（1∶50）、Cleaved Caspase-3（1∶400）、EZH2（1∶50）一抗，4 ℃孵育过夜，加二抗室温孵育50 min，DAB显色，中性树脂封片，光镜下观察，以棕黄色颗粒为阳性表达。使用Image Pro Plus 6.0软件统计阳性表达的积分光密度（IOD）和阳性染色面积（Area），计算平均光密度（MOD）。MOD＝IOD/Area。

2.6 Western blot检测

RIPA裂解液裂解大鼠肾组织，BCA法测定蛋白浓度，等量蛋白上样，电泳，转至 PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭40 min，分别加入Cleaved Caspase-3（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、EZH2（1∶1 000）、H3K27me3（1∶1 000）、GAPDH（1∶10 000）一抗，4 ℃孵育过夜，PBST洗膜，加入HRP标记山羊抗小鼠IgG（1∶1 000）、山羊抗兔IgG（1∶1 000）二抗，室温孵育1 h，PBST洗膜，ECL化学发光液显影，凝胶成像系统成像，以GAPDH为内参，计算目的蛋白相对表达量。

3 统计学方法

4 结果

4.1 降尿酸方对模型大鼠肾功能的影响

与正常组比较，模型组大鼠SCr、BUN、SUA和24 h UTP水平升高，差异有统计学意义（＜0.05）；与模型组比较，降尿酸方组和别嘌醇组大鼠 SCr、BUN、SUA和24 h UTP水平降低，差异有统计学意义（＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠SCr、BUN、SUA和24 h UTP水平比较（±s）

4.2 降尿酸方对模型大鼠肾组织病理形态的影响

与正常组比较，模型组大鼠肾组织结构紊乱，肾小管管腔扩张、管壁变薄，肾间质炎性细胞浸润、纤维化明显，细胞外基质增多；与模型组比较，降尿酸方组和别嘌醇组大鼠肾小管管腔扩张、炎性细胞浸润、纤维组织增生明显减轻。见图1、图2。

图1 各组大鼠肾组织形态（HE染色，×200）

图2 各组大鼠肾组织形态（Masson染色，×200）

4.3 降尿酸方对模型大鼠肾组织细胞凋亡的影响

与正常组比较，模型组大鼠肾组织凋亡细胞数量明显增加，凋亡细胞主要为肾小管细胞；与模型组比较，降尿酸方组和别嘌醇组大鼠肾组织凋亡细胞数量明显减少。见图3。

图3 各组大鼠肾组织细胞凋亡阳性表达（TUNEL染色，×400）

4.4 降尿酸方对模型大鼠肾组织Ⅰ、Ⅳ型胶原蛋白表达的影响

免疫组化染色显示，与正常组比较，模型组大鼠肾组织ColⅠ、ColⅣ蛋白表达明显升高（＜0.01）；与模型组比较，降尿酸方组和别嘌醇组大鼠肾组织ColⅠ、ColⅣ蛋白表达明显降低（＜0.05，＜0.01）。见图4、图5、表2。

表2 各组大鼠肾组织ColⅠ和ColⅣ蛋白表达比较（±s，MOD）

图4 各组大鼠肾组织ColⅠ蛋白阳性表达（免疫组化染色，×200）

图5 各组大鼠肾组织ColⅣ蛋白阳性表达（免疫组化染色，×200）

4.5 降尿酸方对模型大鼠肾组织Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2、EZH2和H3K27me3蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠肾组织 Cleaved Caspase-3、Bax、EZH2、H3K27me3蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低，差异均有统计学意义（＜0.01）；与模型组比较，降尿酸方组和别嘌醇组大鼠肾组织Cleaved Caspase-3、Bax、EZH2、H3K27me3蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达升高，差异均有统计学意义（＜0.01）。见图6、表3。Cleaved Caspase-3和EZH2免疫组化结果与Western blot结果一致。见表4、图7、图8。

图6 各组大鼠肾组织Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2、EZH2和H3K27me3蛋白免疫印迹

表3 各组大鼠肾组织Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2、EZH2、H3K27me3蛋白表达比较（±s，相对表达量）

表4 各组大鼠肾组织 Cleaved Caspase-3、EZH2蛋白表达比较（±s，MOD）

图7 各组大鼠肾组织Cleaved Caspase-3蛋白阳性表达（免疫组化染色，×400）

图8 各组大鼠肾组织EZH2蛋白阳性表达（免疫组化染色，×400）

5 讨论

高尿酸血症是CKD的独立危险因素，高水平尿酸可触发肾脏内细胞氧化应激、炎性反应、内皮损伤、肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活。体外实验显示，尿酸能刺激肾小管上皮细胞凋亡和间充质转分化，直接或间接诱导肾脏成纤维细胞活化，促进肾纤维化进展。对于动物模型建立，研究显示，大鼠予氧嗪酸钾750 mg/kg灌胃5周后出现肾脏动脉病变、肾小管间质炎症和纤维化等病理变化。Cristóbal-García 等给予大鼠氧嗪酸钾 750 mg/kg连续灌胃 11～12周后，大鼠出现高血压、肾血管收缩、肾小管损伤、氧化应激、线粒体功能障碍等变化。Liu等通过给予腺嘌呤和氧嗪酸钾1 500 mg/kg混合液灌胃建立高尿酸血症大鼠模型，实验第4周大鼠肾组织ColⅠ表达升高。本实验以氧嗪酸钾1 500 mg/kg灌胃作为高尿酸血症大鼠的造模方法，实验第 12周模型大鼠SCr、BUN、SUA和24 h UTP水平明显升高（＜0.05），肾组织出现纤维化病理特征，纤维化指标ColⅠ、ColⅣ蛋白表达升高，凋亡细胞明显增多，促凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Bax表达升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低，提示大鼠出现肾功能下降和早期肾纤维化表现。给予降尿酸方干预后，大鼠SCr、BUN、SUA和24 h UTP水平显著降低（＜0.05），肾组织纤维化程度减轻，ColⅠ、ColⅣ蛋白表达降低，凋亡细胞明显减少，Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达降低，Bax蛋白表达升高，提示降尿酸方在治疗大鼠高尿酸血症同时可减轻高尿酸诱导的肾纤维化。

表观遗传修饰通过调控基因表达影响细胞生长、增殖等，在肾脏疾病发生发展中发挥重要作用。组蛋白修饰与多梳抑制复合物 2（PRC2）密切相关，EZH2是重要的组蛋白甲基转移酶之一，作为 PRC2的催化亚基，在H3K27处触发组蛋白H3甲基化，在促纤维化基因表达和调节肾纤维化中发挥重要作用。研究发现，CKD患者肾组织EZH2表达升高，表明EZH2升高与肾脏疾病发生发展具有临床相关性，并且可能与肾纤维化发病机制有关。Barrera-Chimal等发现，EZH2抑制剂或EZH2 siRNA可抑制肾间质成纤维细胞激活、细胞外基质沉积和上皮细胞间质转分化，且抑制EZH2能缓解高尿酸血症小鼠肾小管细胞凋亡及炎性反应。还有研究显示，抑制EZH2能阻止 TGF-β1/Smad3信号通路和 EGFR/ERK1/2信号通路激活，抑制多种促肾纤维化趋化因子和细胞因子分泌。Shi等在高尿酸诱导的肾损伤小鼠模型中发现，抑制EZH2可降低EZH2、Cleaved Caspase-3水平，减轻肾小管上皮细胞凋亡，降低SUA、黄嘌呤氧化酶活性，减轻肾间质纤维化。本研究建立高尿酸血症伴肾损伤、早期肾纤维化大鼠模型，观察其EZH2水平，结果显示，降尿酸方可降低模型大鼠肾组织EZH2蛋白表达，减轻肾组织病理损伤。

中医学认为，痰湿、血瘀在高尿酸血症发生发展过程中发挥关键作用。病程初期饮食不节或先天不足，致痰湿内生，阻滞中焦；中期久病入络或脏气衰退，痰瘀互结；后期邪伤脏腑，肾元衰竭。治宜活血化瘀、化痰降浊，据此创立降尿酸方，方中炒芥子、盐车前子为君，利气豁痰、温中散寒、利小便、通肾气；炒王不留行为臣，祛痰行血通络；佐以粉萆薢、威灵仙祛风除湿、通络止痛，山楂消食健胃、行气散瘀，酒大黄泻热通肠、凉血解毒、逐瘀通经。

综上所述，降尿酸方可减轻高尿酸血症大鼠肾损伤，抑制早期肾纤维化发展，改善肾功能，其机制可能与抑制细胞凋亡、降低肾组织EZH2表达有关。