基于机械敏感性阳离子通道Piezo1的黄芪丹参药物血清对低流体切应力诱导的人内皮细胞功能紊乱的影响

张蒙，龚觉晓，毛晨晗，高昕，张丞波，王新东，

1.南京中医药大学第三临床医学院，江苏 南京 210028；2.南京中医药大学附属中西医结合医院，江苏 南京 210028

血管内皮功能紊乱是高血压、动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）等血管稳态失衡性疾病的始动因素。流体切应力（FSS）是血流作用于血管壁表面产生的平行于血管壁的切线摩擦阻力，直接作用于血管壁表面内皮细胞（ECs）。FSS通过何种途径完成力学向生物学信号的转化从而影响内皮细胞功能，目前尚不十分清楚。有研究表明，与生物力学信号密切相关的新型跨膜蛋白分子机械敏感性阳离子通道Piezo1可能在其中扮演关键角色，Piezo1是ECs的FSS传感器。中医学认为，低FSS可从气虚血瘀的病机角度认识，益气活血法是治疗AS等心血管疾病的关键治法，该法的代表药对黄芪-丹参在治疗心血管疾病气虚血瘀证中应用广泛。本研究基于机械敏感性阳离子通道 Piezo1观察黄芪丹参药物血清对低FSS诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）炎症和功能紊乱的影响，探讨其保护内皮细胞的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与细胞

SD大鼠30只，体质量（220±30）g，雌雄各半，南京中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号SYXK（苏）2018-0049。动物饲养于清洁、（22±2）℃环境，自由摄食饮水，12 h明暗交替。本研究符合南京中医药大学伦理委员会动物实验伦理规范（JL-A2020016）。HUVEC，美国ScienCell公司，货号YS806C。

1.2 药物及血清制备

黄芪、丹参饮片购于南京中医药大学附属中西医结合医院中药房，经江苏省中医药研究院童黄锦药师鉴定为豆科植物膜荚黄芪（Fisch.）Bge.和唇形科植物丹参Bge.的干燥根。根据临床处方常用剂量，将黄芪、丹参以 2∶1比例配伍，按前期实验方法制备原药材浓度为1 g/mL的黄芪丹参水煎液。将30只大鼠随机分为空白组和给药组，每组15只，给药组按4.7 g/（kg•d）灌胃黄芪丹参水煎液（相当于60 kg成人临床用药量的6.25倍），2次/d，连续7 d；空白组灌胃等体积生理盐水。末次灌胃后1 h，乙醚麻醉大鼠，无菌条件下腹主动脉取血，4 ℃静置2 h，3 000 r/min离心15 min，吸取上清液，0.22 µm滤膜过滤除菌，56 ℃水浴灭活30 min，即得空白血清和黄芪丹参药物血清，置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.3 主要试剂与仪器

Piezo1激活剂Yoda-1（美国Selleck公司，货号S6678），胎牛血清（FBS，美国 Gibco公司，货号26140-079），内皮细胞培养基（ECM，美国ScienCell公司，货号8578），Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，货号E-CK-A211），一氧化氮（NO）、内皮素-1（ET-1）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，货号分别为A013-1、A018-1），白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，货号分别为 E-EL-R0012c、E-EL-H0109c），荧光定量 PCR试剂盒（日本Takara公司，货号DRR096A），Piezo1兔多克隆抗体（英国Abcam公司，货号ab259949），内皮型一氧化氮合酶（eNOS）兔多克隆抗体（英国 Abcam 公司，货号ab252439），pro-IL-1β兔多克隆抗体（美国Proteintech公司，货号16806-1-AP）。FSS加载分析设备（美国Flexcell公司，型号STR-4000），细胞培养载玻片（美国 Flexcell公司，型号 CS-U），CO培养箱（美国Thermo Fisher公司，型号HERAcell 150i），倒置显微镜（日本Olympus公司，型号CKX53），酶标仪（中国迈瑞公司，型号 MR-96A），流式细胞仪（美国Thermo Fisher公司，型号Attune NxT），RT-PCR仪（美国Applied Biosystems公司，型号ABI7500），电泳槽（美国Bio-Rad公司，型号Mini-Protean Tetra），电泳转印槽（美国 Bio-Rad公司，型号 Mini Trans-Blot），型离心机（德国 Eppendorf公司，型号5417R）。

1.4 细胞培养、分组及造模

HUVEC用含20%FBS的ECM培养。将细胞分为空白组、模型组、Piezo1激活剂组和芪参血清组，每组5个复孔。消化收集细胞，接种于载玻片上，待细胞融合至80%左右时，给予相应干预。空白组、模型组予15%空白血清培养基，Piezo1激活剂组予含2 μmol/L Yoda-1的15%空白血清培养基，芪参血清组予15%黄芪丹参药物血清培养基，各组继续培养6 h后弃去上清液，将载玻片置于FSS加载分析设备流动小室中，按设备说明书操作，空白组加载正常FSS（1.2 Pa），其余各组加载低FSS（0.12 Pa），于加载6 h收集细胞及灌流液，检测相关指标。

1.5 指标检测

1.5.1 细胞活力检测

收集各组细胞接种于96孔板，MTT法检测细胞活力，每孔加入5%MTT溶液15 μL，37 ℃培养4 h，弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜150 μL，于酶标仪波长570 nm处检测各孔OD值。

1.5.2 细胞凋亡检测

各组细胞分别给予相应干预和FSS处理后，加入10 μL Annexin V-FITC和PI避光染色15 min，于流式细胞仪激发波长488 nm，发射波长530 nm（FITC通道）、617 nm（PI通道）处检测细胞凋亡情况。

1.5.3 细胞灌流液一氧化氮、内皮素-1、白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-α含量检测

细胞灌流液3 000 r/min离心5 min，吸取上清液，硝酸还原酶法检测总硝酸盐（NOX）含量，以 NOX含量表示NO含量，均相竞争法检测ET-1含量，ELISA检测IL-1β和TNF-α含量。

1.5.4 RT-PCR检测细胞Piezo1、内皮型一氧化氮合酶mRNA表达

收集各组细胞，PBS洗涤3次，1 500 r/min离心5 min，弃去上清液，沉淀加入Trizol提取总RNA，反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，荧光定量PCR试剂盒对样品DNA进行分析。根据样品的Ct值，采用2法测定Piezo1和eNOS mRNA相对表达量。引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.5.5 Western blot检测细胞Piezo1、内皮型一氧化氮合酶和pro-白细胞介素-1β蛋白表达

收集各组细胞，加入裂解液提取总蛋白并测定蛋白浓度。等量蛋白上样，经 SDS-PAGE后，转膜至PVDF膜（150 mA、90 min），5%脱脂奶粉封闭1 h，按1∶1 000比例分别加入Piezo1、eNOS和pro-IL-1β一抗，4 ℃孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶1 000），室温孵育1 h，化学发光法显影。以GAPDH为内参，分析目的蛋白条带相对表达量。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 黄芪丹参药物血清对模型细胞活力的影响

MTT结果显示，与空白组比较，模型组细胞活力显著降低（＜0.05）；与模型组比较，Piezo1激活剂组细胞活力无明显变化（＞0.05），芪参血清组细胞活力显著升高（＜0.01）。结果见表2。

表2 各组HUVEC细胞活力比较（±s，OD值）

2.2 黄芪丹参药物血清对模型细胞凋亡的影响

与空白组比较，模型组细胞凋亡率显著升高（＜0.01）；与模型组比较，Piezo1激活剂组和芪参血清组细胞凋亡率显著降低（＜0.01）。结果见图1。

图1 各组 HUVEC 凋亡比较（±s，n＝5）

2.3 黄芪丹参药物血清对模型细胞一氧化氮、内皮素-1、白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-α含量的影响

与空白组比较，模型组细胞灌流液NO含量显著减少（＜0.01），ET-1、IL-1β和TNF-α含量显著增加（＜0.01）；与模型组比较，Piezo1激活剂组和芪参血清组细胞灌流液NO含量显著增加（＜0.01），ET-1、IL-1β和 TNF-α含量显著减少（＜0.01）。结果见表3。

表3 各组 HUVEC灌流液 NO、ET-1、IL-1β和TNF-α含量比较（±s）

2.4 黄芪丹参药物血清对模型细胞 Piezo1和内皮型一氧化氮合酶 mRNA表达的影响

与空白组比较，模型组细胞 Piezo1和 eNOS mRNA表达降低，差异有统计学意义（＜0.01）；与模型组比较，Piezo1激活剂组和芪参血清组细胞Piezo1和eNOS mRNA表达升高，差异有统计学意义（＜0.01）。结果见表4。

表4 各组HUVEC Piezo1和eNOS mRNA表达比较（±s）

2.5 黄芪丹参药物血清对模型细胞Piezo1、内皮型一氧化氮合酶和pro-白细胞介素-1β蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组细胞Piezo1和eNOS蛋白表达显著降低（＜0.01），pro-IL-1β蛋白表达显著升高（＜0.01）；与模型组比较，Piezo1激活剂组和芪参血清组细胞 Piezo1和 eNOS蛋白表达显著升高（＜0.01），pro-IL-1β蛋白表达显著降低（＜0.05，＜0.01）。结果见图2。

图2 各组 HUVEC Piezo1、eNOS和 pro-IL-1β 蛋白表达比较（±s，n＝3）

3 讨论

FSS在维持ECs功能稳态和AS病理进展方面发挥重要作用。AS的易感性与ECs不能在流动方向上排列有关，通常归因于低FSS和/或振荡FSS。生理性的层流FSS（1.5～7 Pa）能使ECs的形态沿血液流动方向拉伸变长，从而维持内皮稳态；低FSS（＜1.0～1.2 Pa）多发生在血管狭窄部位的下游和弯曲部位内侧壁，使ECs不再沿流动方向排列，从而引起内皮功能紊乱，进一步激活炎症信号，加速血管炎症性疾病的进展。研究发现，FSS较低且受方向变化影响的动脉区域可表现出慢性低度炎症；垂直于ECs骨架轴的FSS可激活炎症，而平行方向的FSS则具有抗炎作用。

ECs能感应不同特征的血流，并相应地调节血管生理和重塑。FSS可触发ECs释放多种血管活性介质，其中由eNOS参与生成的NO被认为是最主要的血管舒张因子。血流诱导NO和前列环素呈剂量依赖性分泌是维持FSS恒定的稳态机制。本研究发现，低FSS可诱导HUVEC功能表型发生变化，主要表现为降低细胞活力，促进细胞凋亡，抑制血管舒张因子NO分泌，促进血管收缩因子ET-1分泌，降低eNOS mRNA和蛋白表达。黄芪丹参药物血清可提高细胞活力，抑制细胞凋亡，促进血管舒张因子NO分泌，抑制血管收缩因子ET-1分泌，升高eNOS mRNA及蛋白表达，提示其对ECs具有保护和调节作用。

Piezo1广泛存在于血管ECs和平滑肌细胞中，是机械敏感性阳离子通道，介导机械敏感阳离子电流。研究表明，Piezo1可被FSS和施加在ECs质膜上的侧向力（膜张力）激活，且 Piezo1参与FSS诱导的ECs Ca内流和细胞排列。本研究发现，低FSS可诱导HUVEC Piezo1 mRNA和蛋白表达降低，Piezo1激活剂 Yoda-1可抑制低 FSS诱导的HUVEC凋亡，增加血管舒张因子NO分泌及Piezo1 mRNA和蛋白表达，验证了Piezo1作为感受器在低FSS介导的HUVEC功能紊乱中的关键作用。黄芪丹参药物血清可上调Piezo1 mRNA和蛋白表达，提示其可能通过激活Piezo1抑制低FSS诱导的 HUVEC损伤，从而发挥保护ECs和调节细胞功能的作用。

尽管Piezo1可以介导ECs的流量感应，并且在维持ECs功能中具有重要作用，但ECs Piezo1下游的机制仍不清楚。炎症及炎性微环境的形成是诱导ECs功能障碍的关键机制之一。促炎因子IL-1β在AS炎症的发生发展中起重要作用，靶向IL-1β是当前抗血管炎症药物研发的热点。本研究发现，低 FSS可促进HUVEC炎症因子IL-1β和TNF-α分泌，上调pro-IL-1β蛋白表达，表明低FSS诱导的HUVEC损伤与炎症的相关性。进一步研究发现，Piezo1激活剂Yoda-1和黄芪丹参药物血清均可抑制炎症因子IL-1β和TNF-α分泌，下调pro-IL-1β蛋白表达，提示Piezo1可能介导低FSS相关的ECs炎症，而黄芪丹参药物血清可能通过激活 Piezo1，抑制低 FSS诱导的HUVEC炎症，从而发挥血管内皮保护效应。

综上所述，低FSS可下调HUVEC Piezo1 mRNA和蛋白表达，激活 IL-1β介导的炎症反应，诱导HUVEC凋亡和功能障碍，黄芪丹参药物血清可上调HUVEC Piezol mRNA和蛋白表达，抑制促炎因子IL-1β和 TNF-α分泌，提示黄芪-丹参可能通过上调Piezo1表达，发挥抑制ECs炎症反应、保护ECs功能的作用。