盐析辅助液液萃取-HPLC-MS/MS法检测液态乳中13种双酚类和烷基酚类物质

姜 侃 张 慧 曹 慧 王 瑾 周学军 厉小燕

(1. 浙江省产品质量安全科学研究院，浙江 杭州 310018；2. 浙江科技学院，浙江 杭州 310023)

双酚类物质如双酚A(BPA)、双酚B(BPB)等和烷基酚类物质如壬基酚(NP)等化合物，通常被用于聚碳酸酯环氧树脂等的塑料容器生产中以提高材料的透明度、阻燃性和耐用性[1-2]。由于其具有类似雌激素的特性可干扰人体内分泌系统[3-4]，使人体出现生殖系统异常、性早熟[5]，甚至癌变[6]，2011年卫生部等6部门发布了禁止在婴幼儿奶瓶中使用双酚A的公告，一些塑料制品开始贴上“不含双酚A”的标签。但双酚A的替代物双酚S(BPS)、BPB等，烷基酚及阻燃剂四溴双酚A(TBBPA)等酚类物质的使用，仍然存在诸多安全风险。

目前，常见的乳制品中酚类化合物的检测方法有液相色谱法[7-8]、液相色谱—质谱法[9-11]、气相色谱—质谱法[12]、高分辨质谱法[13]、电化学法[14]、生物传感器法[15]、酶联免疫法[16]等。王力等[7]采用液相色谱法测定了婴幼儿配方奶粉中的双酚A；公丕学等[10]建立了婴幼儿配方乳粉中双酚 A 和壬基酚的超高效液相色谱串联质谱定性定量方法；刘芸等[13]采用高分辨率质谱法检测确证了乳粉及乳制品中的壬基酚和双酚A含量。上述研究多是针对乳制品中双酚A或壬基酚等某几个酚类化合物的研究，而乳制品中酚类物质的高通量检测方法研究尚未见报道。研究拟采用盐析辅助液液萃取，建立液态乳中13种酚类物质同时测定的HPLC-MS/MS检测方法，旨在为食品安全监管和风险评估提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛奶、酸奶样品：市售；

BPA标准品(CAS 80-05-7)：纯度98%，上海安谱实验科技股份有限公司；

BPB(CAS 77-40-7)、双酚AP(BPAP，CAS 1571-75-1)标准品：纯度98%，美国TRC公司；

BPS(CAS 80-09-1)、双酚E(BPE，CAS 2081-08-5)、双酚F(BPF，CAS 620-92-8)、4-正辛基酚(4-n-OP，CAS 1806-26-4)、4-正壬基酚(4-n-NP，CAS 104-40-5)、4-壬基酚(4-NP，CAS 84852-15-3)标准品：纯度99%，北京Bepure公司；

双酚Z(BPZ，CAS 843-55-0)标准品：纯度99%，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；

辛基酚(OP，CAS 27193-28-8)、四氯双酚A(TCBPA，CAS 79-95-8)标准品：纯度99%，美国Accu Standard公司；

TBBPA(CAS 79-94-7)：纯度99%，美国Chem Service公司；

乙腈、正己烷、甲醇：色谱纯，德国Merck公司；

试验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪：LC 20AD型，日本Shimadzu公司；

三重四极杆串联质谱仪：5500QTRAP型，美国AB SCIEX公司；

超纯水仪：Milli-Q型，美国Millipore公司；

电子天平：FA2004型，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；

旋涡混合器：VORTEX2型，德国IKA公司；

离心机：2-16P型，德国SIGMR公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

(1) 标准储备液：分别准确称量各标准品10 mg，用甲醇定容，配成质量浓度为1 g/L的单标储备液，-18 ℃贮存。

(2) 标准工作液：准确吸取1 g/L的单标储备液于同一容量瓶中，配成质量浓度为1 mg/L(BPS和TCBPA为0.2 mg/L)的混合标准溶液，4 ℃贮存。

1.3.2 提取溶剂和盐析试剂的选择 以牛奶为基质，分别采用乙腈、甲醇、乙醇、乙腈/甲醇(V乙腈∶V甲醇为1∶1)各5 mL，乙腈/正己烷(V乙腈∶V正己烷为1∶1)10 mL进行提取，选择适合的提取溶剂。并分别取0.2，0.4，0.6，0.8 g 氯化钠(NaCl)进行盐用量优化选择。

1.3.3 样品处理 准确称取2 g液态乳制品于15 mL具塞离心管中，加入5 mL乙腈涡旋振荡2 min，加入0.4 g氯化钠，涡旋2 min至其溶解，8 000 r/min离心5 min，取乙腈溶液层待测。

1.3.4 仪器参数条件

(1) 色谱条件：Waters AtlantisTMT3色谱柱为2.1 mm×150 mm×3 μm；柱温40 ℃；进样量5.0 μL；流速0.4 mL/min；流动相A为乙腈—甲醇(V乙腈∶V甲醇为1∶1)溶液，流动相B为水；梯度洗脱程序：0～1 min，20% A；1～4 min，20%～95% A，维持4 min；8～8.2 min，95%～20% A；8.2～10 min，20% A，总运行时间10 min。

(2) 质谱条件：电喷雾离子源负离子(ESI-)模式；喷雾电压-4 500 V；离子源温度550 ℃；气帘气241 kPa；雾化气压力345 kPa；辅助加热气379 kPa；多反应监测(MRM)模式。具体条件见表1。

表1 13种酚类物质的质谱参数

1.3.5 方法学验证 以牛奶为基质进行加标试验，分别以3倍信噪比为检出限，10倍信噪比为定量限。

1.3.6 加标回收率与精密度测定 选取牛奶和酸奶样品，分别添加高、中、低3个水平的13种混标溶液，计算加标回收率和相对标准偏差。

1.3.7 数据处理 使用Analyst Software软件采集质谱数据，Multi Quant 3.0.2软件分析数据， Excel软件处理数据。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

选取乙腈、乙腈/正己烷、乙腈/甲醇、乙醇、甲醇作为提取溶剂，对牛奶加标样品进行提取，发现13种酚类物质均有检出，但是由于牛奶中水分含量较高，而提取溶剂乙腈、乙醇和甲醇均与水互溶，水性溶剂使得溶剂体积增大，降低了酚类物质的回收率。因此，采用盐析液液萃取法以使有机提取溶剂与水相分层，从而提高酚类物质的提取效率。13种酚类物质的总离子流色谱图见图1。

1. BPS 2. BPF 3. BPE 4. BPA 5. BPB 6. BPAP 7. BPZ 8. TCBPA 9. TBBPA 10. OP 11. 4-NP 12. 4-n-OP 13. 4-n-NP

在不同提取溶剂萃取后的溶液中加入足量的氯化钠进行盐析处理，只有含有乙腈的提取溶剂与水相出现了分层，经测定目标物回收率，乙腈、乙腈/正己烷均表现出较好的提取效率。牛奶成分复杂，含有的蛋白质、脂肪等物质会对检测产生干扰，乙腈既可以沉淀蛋白质又可以提取目标物质，而正己烷可以减少脂肪的影响。由图2可知，采用乙腈、乙腈/正己烷提取后的各目标物回收率无明显变化，为减少有机溶剂用量、简化试验步骤，选取乙腈作为乳制品中酚类化合物的提取溶剂。

图2 提取溶剂的影响

2.2 盐析试剂和用量的选择

在目标物提取过程中分别加入0.8 g的硫酸铵和氯化钠，考察溶液的分层情况和酚类物质的回收率。结果显示，加入硫酸铵和氯化钠的溶液均出现了有机相和水相的分层，但13种酚类物质的回收率有所不同(见图3)，当以硫酸铵作为盐析试剂时，双酚类物质的回收率较好，均达到80%以上；而烷基酚类物质4-NP、4-n-NP、OP、4-n-OP的回收率偏低，均在80%以下。当以氯化钠为盐析试剂时，各类物质的回收率均较好。因此，选择氯化钠作为盐析试剂。

图3 无机盐类型的影响

由图4可知，当氯化钠用量为0.2～0.8 g时，样品提取液均有分层，当用量为0.4 g时，各物质回收率明显增加，当用量为0.4～0.8 g时，各物质回收率变化不大，说明0.4 g氯化钠即可满足盐析要求，此时乙腈分层且萃取效率较佳，目标物回收率为82.4%～110.3%。因此，选择氯化钠用量为0.4 g。

图4 NaCl用量的影响

2.3 基质效应

基质效应通常采用基质标准曲线斜率与流动相标准曲线斜率的比值进行评价，一般以斜率比值在0.8～1.2范围内作为衡量标准[17]。试验以牛乳和酸奶为基质时13种酚类物质的斜率比值分别为0.38～1.09，0.39～1.22，说明不同类型的液态乳均具有一定的基质效应。为减少基质效应的影响，采用乳制品基质标准曲线对化合物进行定量分析。

2.4 线性方程、检出限与定量限

以空白基质样液中加入混标溶液配置系列标准混合溶液，以物质浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线并考察13种化合物的线性。由表2可知，13种酚类化合物在其质量浓度范围内线性关系良好，相关系数为0.992 5～0.999 1。

表2 酚类物质的线性方程、相关系数、检出限和定量限

2.5 加标回收率与精密度

由表3可知，牛奶中13种酚类物质的回收率为81.5%～118.1%，相对标准偏差为1.89%～12.30%(n=3)；酸奶中酚类物质的回收率为80.8%～107.6%，相对标准偏差为1.12%～11.90%(n=3)，说明试验方法适合液态乳制品样品中双酚类和烷基酚类化合物的分析测定。

表3 酚类物质的回收率与精密度

2.6 样品分析

采用所建方法对市售的15个纯牛奶和酸奶样品进行检测，仅1个样品检出4-NP，含量为9.28 μg/kg；其他样品均未检出双酚类和烷基酚类化合物。4-NP是一种典型的内分泌干扰物，试验检出的样品尽管数量少、含量低，但其检出提醒了人们应关注食品中烷基酚类物质的污染风险。

3 结论

建立了盐析辅助液液萃取、HPLC-MS/MS法同时检测液态乳中13种双酚类和烷基酚类物质的检测方法。结果表明，样品采用乙腈提取，氯化钠为盐析助剂使乙腈分层，前处理过程简单、提取效率高。13种酚类物质在其质量浓度范围内线性关系良好，相关系数均>0.99；在牛奶和酸奶中的加标回收率分别为81.5%～118.1%，80.8%～107.6%，相对标准偏差分别为1.89%～12.30%，1.12%～11.90%；方法检出限为0.15～0.75 μg/kg，定量限为0.5～2.5 μg/kg。采用该法对市售15批次液态乳样品中的酚类物质进行检测，1个样品中检出含有4-NP，含量为9.28 μg/kg。后续可研究包装材料中酚类化合物向乳制品中的迁移规律，并可加强对不同贮藏或应用条件下乳制品中酚类化合物的风险监测。