发酵乳杆菌BLHN3的高密度培养优化

左梦楠 刘 伟,2,3 张菊华,2,3 全 琦

(1. 湖南大学研究生院隆平分院，湖南 长沙 410000；2. 湖南省农业科学院农产品加工研究所，湖南 长沙 410000；3. 果蔬贮藏加工与质量安全湖南省重点实验室，湖南 长沙 410000)

发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)不仅可以改善食品风味[1]，增加营养[2]，还具有降胆固醇[3]、抗病毒[4]、提高免疫、促进肠道健康等益生特性[5]。发酵乳杆菌代谢产物如胞外多糖(EPS)、抗菌肽，可以作为食品添加剂[6]、食品防腐剂或抗生素的替代品等[7]，在食品保鲜方面也有重要应用[8]。

高密度培养是制备高效型发酵剂的前提，培养基作为菌体的营养物质来源，优化培养基是获得乳酸菌高密度培养的关键。胡渊等[9]优化了干酪乳杆菌高密度培养的营养成分，活菌数达到2.81×1012CFU/mL，较在MRS培养基中培养提高了8.21倍。郑柳青[10]对鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01的生长条件进行了响应面优化，其活菌数为9.08×108CFU/mL。Zhang等[11]通过Box-Behnken设计优化了培养基组分9.5 g/L葡萄糖、15.5 g/L水解酪蛋白和7.0 mg/L谷氨酸，保加利亚乳杆菌活菌数达(2.95±0.07)×109CFU/mL。Gutuierrez-Sarmiento等[12]对植物乳杆菌BAL-03-ITTG的培养条件进行了响应面优化，活菌数为7.10×109CFU/mL。Wang等[13]对鼠李糖乳杆菌LS-8的培养基和发酵条件进行了优化，活菌数提高到4.5×109CFU/mL。综上，优化培养基成分和培养条件对提高发酵乳杆菌的密度具有重要意义。

发酵乳杆菌BLHN3是从自然发酵的剁辣椒中分离筛选出的抗氧化能力较强、产香性能优良的菌株，将其制备成直投式发酵剂应用于剁辣椒加工，有望提升产品发酵品质和生产效率[14]。研究拟采用单因素和响应面优化试验，以MRS培养基为对照，探究发酵乳杆菌BLHN3菌株的最适培养基组分及生长条件，以期为发酵乳杆菌BLHN3发酵剂的制备提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

发酵乳杆菌BLHN3(LactobacillusfermentumBLHN3)：-80 ℃甘油保藏；

MRS肉汤培养基、MRS琼脂培养基、大豆蛋白胨、细菌学蛋白胨、酵母提取粉、牛肉浸粉：生物试剂，广东环凯微生物科技有限公司；

乳清蛋白粉WPC90：食品级，浙江一诺生物科技有限公司；

菊粉、结晶海藻糖：食品级，郑州明欣化工产品有限公司；

无水葡萄糖：食品级，西王药业有限公司；

蔗糖、乳糖：食品级，美国Leprino Foods公司；

可溶性淀粉、D-半乳糖：食品级，安徽山河药用辅料股份有限公司；

胡萝卜、平菇、土豆、包菜、西红柿、黄浆水：市售。

1.1.2 主要仪器设备

电子天平：AS 220.R2型，苏州培科实验室仪器科技有限公司；

紫外可见分光光度计：T6新世纪，北京普析通用仪器有限责任公司；

pH计：雷磁PHS-3E型，上海仪电科学仪器股份有限公司；

超净工作台：SW-CJ-1C型，苏州市金净净化设备科技有限公司；

灭菌锅：LDZM-80L-III型，上海申安医疗器械厂；

冷冻离心机：Avant J-26XP型，美国贝克曼库尔特有限公司；

生化培养箱：SPX-150型，中仪国科(北京)科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化培养 将甘油管保藏的菌种按体积分数3%接种于10 mL的MRS肉汤培养基中，37 ℃培养24 h作为第一代菌种，再培养14 h进行传代培养2次。

1.2.2 活菌数测定 参照GB 4789.35—2016。

1.2.3 菌株生长曲线 将活化菌株以体积分数3%接种量接种至MRS肉汤培养基中，37 ℃发酵静置培养1 d，每隔2 h取样，测定pH、OD600 nm值和活菌数。

1.2.4 发酵培养基单因素试验

(1) MRS培养基组成：细菌学蛋白胨10 g，牛肉浸粉10 g，酵母提取粉4 g，葡萄糖20 g，柠檬酸铵2 g，乙酸钠5 g，磷酸氢二钾2 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.05 g，吐温-80 1 mL，蒸馏水1 000 mL。

(2) 增菌因子制备方法：胡萝卜、包菜、土豆、平菇、西红柿经预处理后加5倍水榨汁，与黄浆水分别经双层纱布过滤，冷藏备用。

(3) 发酵培养基碳源、氮源、缓冲盐及增菌因子营养成分的筛选：以MRS培养基为基础，分别以20 g/L海藻糖、蔗糖、乳糖、D-半乳糖、淀粉、菊粉代替MRS培养基中的碳源；在碳源优化的基础上，分别添加24 g/L的牛肉浸粉、细菌学蛋白胨、乳清蛋白粉、酵母提取粉、大豆蛋白胨代替MRS培养基中的氮源；在碳、氮源优化的基础上，分别添加9 g/L的柠檬酸铵/乙酸钠/磷酸氢二钾、乙酸钠、柠檬酸钠/磷酸氢二钾、磷酸氢二钾/乙酸钠/柠檬酸钠、磷酸二氢钾/磷酸氢二钠、磷酸氢二钾/磷酸二氢钾代替MRS培养基中的缓冲盐。静置培养14 h测定活菌数；在前期优化基础上，研究增菌因子(体积分数10%)黄浆水、胡萝卜汁、包菜汁、土豆汁、平菇汁、西红柿汁对菌株生长的影响，保持其他组分不变，静置培养14 h后测定活菌数。

(4) 发酵培养基成分单因素优化：确定最佳碳源、氮源、缓冲盐及增菌因子后，分别调整不同组分的添加量，以3%接种量静置培养14 h，以活菌数为考核指标确定最佳添加量。

1.2.5 发酵培养基响应面优化试验 在单因素试验基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，选择对发酵乳杆菌BLHN3活菌数影响显著的海藻糖、大豆蛋白胨、胡萝卜汁添加量为自变量，活菌数为响应值，优化发酵乳杆菌BLHN3的培养基。

1.2.6 培养条件优化

(1) 初始pH：将活化菌株以3%接种量接种至初始pH为4.0，6.0，8.0，10.0，12.0的优化培养基中，37 ℃静置培养1 d，测定活菌数。

(2) 培养温度：将活化菌株以3%接种量接种至优化培养基中，分别于21，25，29，33，37，41，45，49 ℃静置培养1 d，测定活菌数。

(3) 接种量：将活化菌株以1%，2%，3%，4%，5%接种量接种至优化培养基中，37 ℃静置培养1 d，测定活菌数。

(4) 装液量：将活化菌株以最佳接种量分别接种至装有15，30，45，60，75，90 mL培养基的三角瓶中，37 ℃静置培养1 d，测定活菌数。

1.2.7 半连续高密度培养 将活化菌株以3%接种量接种至优化培养基中，37 ℃静置培养14 h，3 800 r/min离心10 min[15]，再用等量新鲜培养基替换原发酵液，继续培养2.5～3.0 h，测定活菌数，按式(1)计算比生长速率。

μ=(lny2-lny1)/(t2-t1)，

(1)

式中：

μ——比生长速率，h-1；

y1、y2——t1、t2时的乳酸菌量，CFU；

t1、t2——时间，h。

1.3 数据处理

每组试验平行3次，采用Origin软件作图。利用IBM SPSS Statistics 25软件进行单因素方差分析，Duncan法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 发酵乳杆菌生长曲线

由图1可知，发酵乳杆菌的生长曲线和OD600 nm值曲线变化基本一致。0～2 h为发酵乳杆菌BLHN3生长停滞期，此时期活菌数变化相对较小；2～14 h为发酵乳杆菌BLHN3对数生长期，此时期营养物质丰富、细胞生长旺盛；14～18 h为发酵乳杆菌BLHN3生长稳定期，此时期活菌数基本稳定，细胞死亡数与增殖数趋于平衡；18 h后为生长衰亡期，增殖速率变慢，死亡菌数增多，活菌数呈下降趋势。从pH变化曲线可知，pH在2～8 h下降迅速，8 h后基本稳定，是因为乳酸菌发酵过程不断产生乳酸，但过多的乳酸会抑制乳酸菌生长，导致产酸减少。

图1 发酵乳杆菌BLHN3生长曲线

2.2 发酵培养基单因素试验

2.2.1 最佳碳源 由图2(a)可知，相同添加量下，不同种类糖源对发酵乳杆菌生长的影响不同。海藻糖对发酵乳杆菌BLHN3的促生长作用最佳，活菌数为4.90×109CFU/mL；乳糖、D-半乳糖、蔗糖的促生长效果差异不显著，活菌数为3×109CFU/mL左右；葡萄糖中的活菌数为2.07×109CFU/mL；淀粉和菊粉的促生长效果较差，活菌数分别为2.00×108，5.50×108CFU/mL。不同乳酸菌代谢糖类及代谢途径有差别，葡萄糖是异型发酵乳杆菌的最佳碳源[16]，唾液乳杆菌BBE 09-18在麦芽糖中生长效果最好，活菌数可达1.88×109CFU/mL[17]；黄秀敏等[18]研究发现乳杆菌对单糖利用率较高，可能是乳杆菌对单糖的代谢能力比较强。综上，不同乳酸菌对糖类的偏好性不一样，因此选择海藻糖作为发酵乳杆菌BLHN3最佳碳源。

2.2.2 最佳氮源 由图2(b)可知，牛肉浸粉和大豆蛋白胨对发酵乳杆菌的促生长效果最好，二者无显著差异，细菌学蛋白胨和酵母浸粉次之，乳清蛋白粉的效果最差。孙媛媛等[19]研究表明，酵母粉复合大分子肽的蛋白胨是发酵乳杆菌的最适氮源。氮源是乳酸菌生长中的关键成分，且在乳酸菌规模化应用中的成本高，考虑到以牛肉浸粉作氮源的成本较高，因此选择价格低廉、促生长效果好的大豆蛋白胨作为发酵乳杆菌BLHN3的氮源，活菌数可达5.23×109CFU/mL。

2.2.3 最佳缓冲盐 由图2(c)可知，当缓冲液为柠檬酸铵/乙酸钠/磷酸氢二钾时，发酵液活菌数最高，效果最显著，其次是柠檬酸钠/磷酸氢二钾，乙酸钠、磷酸二氢钾/磷酸氢二钠、磷酸氢二钾/磷酸二氢钾三者无显著性差异，而磷酸氢二钾/乙酸钠/柠檬酸钠促生长效果最差。常用的缓冲盐体系有柠檬酸盐、磷酸盐和乙酸盐等，多种缓冲盐组分效果更佳，与Chen等[20]的结论一致。柠檬酸盐可以增强乳酸菌细胞EMP途径中碳通量和ATP的产生，柠檬酸铵还可作为乳酸菌生长的无机氮源[21-22]。因此，选择柠檬酸铵/乙酸钠/磷酸氢二钾为发酵乳杆菌BLHN3最佳缓冲盐。

2.2.4 最佳增菌因子 由图2(d)可知，相同体积分数下，胡萝卜汁的促生长效果最显著，其次是黄浆水和土豆汁。胡萝卜汁营养丰富，含有大量多糖、蛋白质、β-胡萝卜素，可作为促生长因子提高乳酸菌菌群丰度[23]。Kun等[24]研究发现双歧杆菌在纯胡萝卜汁上生长效果良好。大豆黄浆水是豆腐生产过程中的副产物，富含蛋白质、糖、大豆异黄酮、皂苷等多种成分，是适宜微生物生长的优良基质[25]。土豆中含有淀粉、膳食纤维、钙、磷、铁等，程方方[26]研究表明肠膜明串珠菌C27最适增菌因子为土豆汁。在以相同体积分数的平菇汁、西红柿汁和包菜汁为增菌因子的试验中，发酵乳杆菌生长效果较差，可能是因为平菇汁成分不适合发酵乳杆菌的生长，包菜汁中营养物质较单一、西红柿汁pH较低等阻碍其生长。尤倩倩[27]发现平菇汁、西红柿汁对干酪乳杆菌的促生长效果不显著。吴祖芳等[28]研究表明植物乳杆菌 H17在西红柿汁和Na2CO3溶液共同培养下菌体量有显著提升。因此，选择胡萝卜汁作为发酵乳杆菌BLHN3的最佳增菌因子。

A～F分别为柠檬酸铵/乙酸钠/磷酸氢二钾、乙酸钠、柠檬酸钠/磷酸氢二钾、磷酸氢二钾/乙酸钠/柠檬酸钠、磷酸二氢钾/磷酸氢二钠、磷酸氢二钾/磷酸二氢钾；字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.2.5 营养成分添加量 由图3(a)可知，发酵乳杆菌BLHN3活菌数随海藻糖添加量的增加呈先上升后下降的趋势，当海藻糖添加量为30 g/L时，发酵液活菌数达最大值；当海藻糖添加量>30 g/L时，活菌数下降，可能是初始底物糖浓度过高抑制了乳酸菌快速生长[29]。由图3(b)可知，发酵乳杆菌BLHN3活菌数随大豆蛋白胨添加量的增加逐渐增加，当大豆蛋白胨含量>34 g/L时，活菌数保持稳定，表明乳酸菌可通过分解利用外源蛋白质高效增殖[30]。由图3(c)可知，发酵乳杆菌BLHN3活菌数随缓冲盐添加量的增加先上升后下降，当缓冲盐添加量为9 g/L时活菌数达最大值，与王建等[31]的结论一致。由图3(d)可知，发酵乳杆菌BLHN3活菌数随胡萝卜汁添加量的增加先上升后趋于平缓，当胡萝卜汁添加量为10%时活菌数最高。

图3 菌株在不同培养基成分添加量下的活菌数

2.3 发酵培养基响应面优化试验

2.3.1 响应面试验设计与结果 基于单因素试验结果，选择对发酵乳杆菌BLHN3影响显著的碳源海藻糖添加量、氮源大豆蛋白胨添加量以及胡萝卜汁添加量为自变量，以活菌数为响应值，设计三因素三水平响应面试验，试验因素与水平设计见表1，试验方案及结果见表2。

表1 响应面因素水平

表2 响应面试验设计及结果

采用Design-Expert 8.0.6软件对试验数据进行二次响应面回归分析，得到发酵乳杆菌活菌数与各因变量的模拟方程：

Y=+5.75-0.14A+1.61B-0.32C+0.53AB-0.060AC+0.37BC-0.99A2-0.72B2-0.68C2。

(2)

2.3.3 响应面分析 由图4可知，当胡萝卜汁添加量和大豆蛋白胨添加量不变时，随着海藻糖添加量的升高，发酵液活菌数先升高后下降。当胡萝卜汁添加量和海藻糖添加量不变时，随着大豆蛋白胨添加量的增加，发酵液活菌数逐渐升高。当海藻糖添加量和大豆蛋白胨添加量不变时，随着胡萝卜汁添加量的增加，发酵液活菌数先升高后趋于平缓。根据等高线图可知，AB、BC的等高线呈椭圆形，说明AB、BC的交互作用显著；AC的等高线接近圆形，说明AC的交互作用不显著。

图4 各因素交互作用对活菌数的影响

通过回归模型预测高密度培养的培养基最优组成为海藻糖30.0 g/L、大豆蛋白胨34.0 g/L、胡萝卜汁9.96%，活菌数预测值为6.05×109CFU/mL。为便于操作，将胡萝卜汁修正为10%，并进行验证实验，发酵乳杆菌高密度培养的活菌数可达(6.05±0.05)×109CFU/mL，比MRS培养基的活菌数提高了2.91倍，证明所建模型的适用性。

2.4 培养条件优化

2.4.1 初始pH 由图5(a)可知，当pH为6时，发酵乳杆菌活菌数最高，表明此时发酵乳杆菌的生长效果最好，与发酵乳杆菌LF-8001最适初始pH一致[32]。当pH>6时，发酵乳杆菌活菌数开始下降；当pH>8时，活菌数急速下降；当pH为12时，活菌数仅7.33 lg(CFU/mL)。不同微生物对pH有一定的耐受性，过酸或过碱的环境均不利于乳酸菌生长[33]。因此，选择pH 6作为菌体生长最佳初始pH。

2.4.2 培养温度 由图5(b)可知，当培养温度<37 ℃时，随着培养温度的升高，活菌数逐渐增加，表明发酵乳杆菌随培养温度的升高，生长得越快，可能是因为随培养温度的升高，细胞流动性在一定范围内得到提升，物质运输能力进一步加强，有利于乳酸菌细胞生长代谢等[34]；当培养温度>37 ℃时，随培养温度的升高，活菌数快速降低，49 ℃时活菌数降至7.22 lg(CFU/mL)。培养温度过高导致乳酸菌的细胞膜流动性、蛋白质活力和酶活性受损[35]，发酵乳杆菌因失活而生长受到抑制，活菌数降低；培养温度为37 ℃时活菌数最高，表明此温度是发酵乳杆菌较适宜的培养温度，与对鼠李糖乳杆菌grx10[36]、发酵乳杆菌IMAU 10129[37]的研究结果一致。因此，选择37 ℃作为菌体最佳生长温度。

2.4.3 接种量 由图5(c)可知，当接种量<3%时，随着接种量的增加，发酵液活菌数上升；当接种量>3%时，随着接种量的增加，发酵液活菌数不再增加，反而越来越低。因此，选择3%作为菌体最佳接种量。

2.4.4 装液量 由图5(d)可知，当装液量为30 mL时，发酵乳杆菌活菌数最高，是因为发酵乳杆菌在适量氧气存在下进行有氧呼吸，加快了能量代谢水平，促进自身生长繁殖[38]。当装液量为15 mL时，发酵液活菌数最低，与Siciliano等[39]研究一致，表明过高的溶氧量对细胞存活和生长具有负面作用。当装液量>30 mL时，随着装液量的增加，溶氧量越少，发酵液活菌数逐渐下降，但变化不显著。因此，选择30 mL作为菌体最佳装液量，即培养体积分数约为1/5。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.5 半连续高密度培养

由图6可知，在优化培养基的基础上进行半连续高密度培养工艺的探索，将培养至对数后期的发酵液离心，补充等量新鲜培养基换液培养后可明显提高发酵液活菌数，离心前活菌数为9.77 lg(CFU/mL)，选择14 h进行离心更换新鲜培养基后培养2.5～3.0 h，相同条件下重复培养多次，发酵液活菌数持续增加，最高可达10.08 lg(CFU/mL)。乳酸菌多次离心换液后比生长速率变化一致，均呈下降趋势，表明随着菌体浓度的增加，抑制了菌体的迅速生长。发酵液活菌数在第4次离心培养后开始下降，说明随着培养时间的延长，大部分菌体已进入衰亡期，半连续高密度培养重复进行2～3次为最佳，与于修鑑[40]的结果一致。此时细胞仍保持增殖活力，乳酸菌活菌数仍可继续上升，之后活菌数开始下降，细胞活力显著降低。因此，离心培养2～3次可作为半连续培养收获菌体最佳批次，活菌数可达10 lg(CFU/mL)，较离心前提高一个数量级。

图6 发酵乳杆菌BLHN3半连续高密度培养

3 结论

试验表明，以MRS培养基为基础，发酵乳杆菌BLHN3在海藻糖30.0 g/L、大豆蛋白胨34.0 g/L、胡萝卜汁体积分数10%、柠檬酸铵/乙酸钠/磷酸氢二钾缓冲盐类物质下的活菌数最高，为6.05×109CFU/mL，是MRS培养基的2.91倍；发酵乳杆菌BLHN3的最佳培养初始pH为6、培养温度为37 ℃、接种量为3%(体积分数)、装液量为30 mL(即培养体积分数1/5)；并对发酵乳杆菌进行半连续高密度培养，较离心前培养活菌数显著提高(P<0.05)，表明发酵乳杆菌BLHN3经高密度培养，有望成为具有应用潜力的发酵剂。后续将深入探究其冷冻干燥特性，制备直投式发酵剂，以便其应用于剁辣椒的工业化生产。