物理终止发酵工艺对低醇枣酒风味物质的影响

尹 蓉 张倩茹 王俊宇 梁志宏

(山西农业大学果树研究所，山西 太原 030031)

低醇枣酒不仅酒精度低，且甲醇、杂多醇等有害物质含量少[1]，还能更好地保留枣果中多糖、多酚、黄酮、花色苷、有机酸等营养与功能性成分[2-3]。国外对低醇酒的研究与生产始于20世纪70年代，目前在市场中上升趋势非常明显；中国的低醇酒研发起步较晚，亟待进行产业化研发[3-4]。在枣酒生产中，很难避免枣干红酒甲醇、杂多醇和生物胺超标的严重问题，枣酒生产企业面临着有产品但无法上市的困境。已有研究[1,5]表明，枣酒发酵前期进行的单糖或果聚糖发酵，产生的甲醇等有害物含量很低，但后期的多聚糖、糖酸复合物发酵会产生大量甲醇、杂多醇和生物胺。如果将枣汁发酵尽量控制在单糖、果聚糖发酵阶段，生产低醇高糖的枣酒，将会有效控制这些有害物质的产生。

终止发酵法是制作低醇果酒常用也是成本较低的方法，但不同的终止发酵法对低醇果酒品质的影响存在差异。王琰等[6]研究表明，脉冲电场方波在场强15 kV/cm下有效处理80 μs、75 ℃水浴恒温热处理20 min、添加150 mg/L二氧化硫均可达到终止发酵的目的；不同终止发酵方式主要影响菠萝酒的色泽、香气和感官分析；结合感官分析，脉冲电场终止发酵法制备的菠萝低醇酒品质为最优。杨凯等[7]比较了添加不同浓度的肉桂酸，以及肉桂酸协同60 mg/L SO2共同终止酒精发酵相对于单纯使用SO2对低醇葡萄酒品质的影响，发现添加肉桂酸的试验均优于未添加的试验，而且单纯添加250 mg/L肉桂酸进行终止发酵能获得品质最佳且稳定性最好的低醇葡萄酒。崔媛媛等[8]研究证明在低醇沙棘蜂蜜酒生产中，相较于加硫处理，超高压技术可明显改善酒样的香气和色泽品质。

关于枣酒的终止发酵在枣汽酒饮品的研究中进行过初步研究[1]，但方法较单一，且添加了较大量的SO2，对枣酒的风味有负面影响。研究拟以市售的优质大枣品种哈密大枣为原料，采用巴氏灭菌、高频超声和超微过滤处理3种物理方法进行酒精发酵终止试验，比较不同处理下低醇枣酒有机酸、糖类、甘油和香气物质的含量，以期为低醇枣酒的产业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

干哈密大枣：原产地为新疆哈密，市售；

拉曼德优质果酒酵母干粉：曼森酵母旗舰店；

酒石酸、琥珀酸、柠檬酸、乳酸、苹果酸、醋酸标准品：上海源叶生物有限公司；

C18SPE固相萃取小柱(十八烷基硅胶填充物500 mg)：北京吉瑞森科技有限责任公司；

乙腈、无水醋酸钠、氢氧化钠：优级纯，默克化学试剂有限公司；

甘油、氯化锂：分析纯，深圳市勋业化学试剂有限公司；

浓硫酸、果糖、葡萄糖：化学纯，深圳市勋业化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

离子色谱仪：930 Compact IC Flex 智能集成型，瑞士万通有限公司；

固相萃取装置：SPE100型，济南海能仪器股份有限公司；

气相色谱—质谱联用仪：Thermo Trace1300ISQ型，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；

巴氏灭菌锅：BS-2型，山东省诸城市利德机械有限公司；

超声仪：AS5150型，天津奥德赛恩斯仪器有限公司；

果酒过滤器：双级过滤器-1型，配5 μm PP棉滤芯和0.22 μm聚丙烯滤芯，烟台帝伯仕自酿机有限公司；

菌落计数器：VS-J3型，无锡沃信仪器制造有限公司。

1.3 发酵工艺流程

干红枣→清洗→切割(每颗枣切割3刀)→加热提汁(加入纯净水煮至即将沸腾，常温静置提汁24 h)→过滤(300目筛网)→调糖度(加热浓缩至糖度为20 °Brix)→菌种活化及接种(以0.4 g/L的质量浓度称取活性干酵母，加入适量质量浓度为20 g/L的葡萄糖溶液，置于37 ℃ 水浴锅中连续搅拌15 min，而后加入枣汁中，并混合均匀)→发酵(20 ℃密闭发酵)→监测酒精度→终止发酵→取样测定

1.4 终止发酵方法

每日监测酒精度，大约发酵5～6 d时，酒精度接近于7%，分别于巴氏灭菌锅、超声仪、精密膜果酒过滤器进行巴氏灭菌处理、高频超声处理、超微过滤处理终止发酵。

酵母菌最高致死温度为55～56 ℃，但较低温度的热处理需要较长时间才能终止发酵，而较高温度又会加速酒精挥发，因此巴氏灭菌以70 ℃作为处理温度，经过一定时间的处理后，迅速降至4 ℃；超声仪具有40 kHz的低频挡和59 kHz的高频挡，低频挡无法有效破坏酵母细胞，故超声处理选择高频档；酵母菌细胞宽度约1～5 μm，长度为5～30 μm，为有效过滤酵母，超微过滤处理中先利用5 μm PP棉滤芯进行一次过滤、再利用0.22 μm聚丙烯滤芯进行二次过滤。

1.5 测定方法

1.5.1 有机酸、甘油、果糖、葡萄糖含量测定 有机酸测定参照文献[9]的方法，甘油、果糖、葡萄糖测定参照文献[10]的方法，均运用离子色谱法进行测定，标准曲线见表1和表2。

1.5.2 香气成分提取及测定 参照文献[11]。

表1 有机酸标准曲线方程

表2 甘油、葡萄糖、果糖标准曲线方程

1.5.3 感官评价 将酒样放于通风良好的房间，由10位受到专业培训的品评小组成员分别对低醇枣酒酒样进行感官品评。感官品评项目包括果香、发酵香、色泽、酸味、甜味、苦味、余味、口感平衡度。按照10分制对每个项目的强烈程度打分，之后将各得分进行统计分析。

1.6 数据分析

采用Excel和SPSS 24进行数据处理和分析。

2 结果与分析

2.1 低醇枣酒物理终止发酵工艺的确定

巴氏灭菌处理可以有效杀死酵母菌，避免再发酵的可能。高频超声处理可以迅速产生高能微气泡和空穴效应，使酒体处于短暂性的高温高压状态，大大提高酵母细胞破碎的速率和程度[12]。超微过滤处理可以过滤掉酵母和枣酒中的悬浮物质，增加酒体稳定性。不同物理终止发酵处理下酵母菌菌落数和酒精度见表3。

表3 不同物理终止发酵处理枣酒的酵母菌菌落数和酒精度

由表3可知，70 ℃巴氏灭菌20 min、高频超声处理20 min和超微过滤处理后，基本检测不出酵母菌，而且采取终止发酵工艺7 d后，酒精度未增长，说明这3种终止发酵工艺有效。

2.2 物理终止发酵工艺对低醇枣酒品质的影响

2.2.1 有机酸含量 酸味物质构成枣酒爽利、清新等口感特征。酸度过高使人感到刺口、生硬、酸苦；酸度过低则使人感到腻口、乏味、平淡。枣酒中能被识别出酸味的物质是一系列游离状态的有机酸，主要包括苹果酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、奎宁酸和乙酸等。哈密大枣酿制的低醇枣酒中检测到苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、乳酸和乙酸5种。不同终止发酵工艺下低醇枣酒有机酸含量见图1。主要来源于枣果本身的苹果酸、柠檬酸[12]是低醇枣酒中含量最高的有机酸，琥珀酸、乙酸和乳酸均主要来源于发酵[13]8-9，但琥珀酸、乙酸居于中等，乳酸含量则为最低，且在3种处理中含量基本无差异，这是因为乳酸主要产生于发酵后期。

图1 不同终止发酵工艺低醇枣酒有机酸含量

苹果酸是枣酒中最酸的酸，口感尖刻且呈味时间长；柠檬酸味感新鲜、凉爽和圆润；琥珀酸刚入口时酸味较淡，随后味感变浓，并能引起唾液分泌，可增强枣酒醇厚感；乙酸具醋味，刺鼻又刺喉[13]10。巴氏灭菌处理的低醇枣酒柠檬酸、苹果酸含量均为最低，乙酸含量居于中等，意味着该处理的酸味味感低。超微过滤处理的低醇枣酒柠檬酸和苹果酸含量最高，琥珀酸和乙酸含量比另外两种处理低。高频超声处理的低醇枣酒乙酸含量为最高，其他指标则居于中等。而乙酸在果酒中具有预示着变质的倾向，说明高频超声处理可能会对低醇枣酒的贮藏产生负面影响。

2.2.2 甘油、果糖和葡萄糖含量 枣酒发酵终止后残糖的主要成分是葡萄糖和果糖[14-15]。而主要呈甜物质除葡萄糖和果糖外，还包括甘油。甘油可以使低醇枣酒呈现肥硕、圆润的口感。三者是决定枣酒味感品质的重要指标。由图2可知，不同终止发酵工艺处理的低醇枣酒甘油、葡萄糖和果糖存在较为明显的差异。甘油含量最高的是巴氏灭菌处理的低醇枣酒，最低的是超微过滤处理的低醇枣酒。这可能是因为甘油具有黏性，在过滤中会损失一部分。再结合有机酸分析中，超微过滤的低醇枣酒琥珀酸含量最低，意味着该处理下缺乏醇厚丰硕的口感。巴氏灭菌和超微过滤处理的低醇枣酒中葡萄糖、果糖都较高，而超声处理二者含量都为最低。具体原因有待进一步研究。

图2 不同终止发酵工艺低醇枣酒甘油、葡萄糖和果糖含量

2.2.3 香气物质 3种工艺处理的低醇枣酒香气成分的总离子流色谱图见图3～图5，香气成分组成及含量见表4 和表5。

图3 巴氏灭菌终止发酵枣酒香气成分GC-MS总离子流图

图4 高频超声终止发酵枣酒香气成分GC-MS总离子流图

图5 超微过滤终止发酵枣酒香气成分GC-MS总离子流图

表4 不同终止发酵低醇枣酒香气物质组成及含量

续表4

低醇发酵的哈密大枣枣酒共检测到50种香气物质，其中酯类物质达34种，可见酯类物质是主要的香气构成成分，与前人[11-12]的研究结果一致。3种不同终止发酵方式处理的枣酒中，辛酸乙酯和癸酸乙酯都是含量最高的香气成分，说明这两种酯类是低醇枣酒的代表性香气成分。

巴氏灭菌处理的低醇枣酒检测到香气物质种类最少，共有27种。特有香气成分包括异戊酸己酯、DL-2-氨基丙酸、大马士酮和2-乙基己醇4种，在3种处理中种类为最少。另含有高水平的异戊醇，异戊醇是一种杂醇，且呈现不愉快的味道[16-17]。烷类物质含量也明显较高。可见巴氏灭菌对枣酒风味物质有负面影响。

超声高频处理的低醇枣酒检测到32种香气物质。特有香气成分共8种，其中乙酸异丁酯、甲酸异戊酯、3-甲基丁酸乙酯、辛酸甲酯呈现各种水果香，苯乙醛呈风信子香，2-壬酮呈花、果、油脂和药草香[16-17]。另外，乙酸异戊酯(香蕉味)和苯乙醇(玫瑰花香)含量高，而烷类物质含量低。因此，该处理下的低醇枣酒具有丰富的香味成分。

超微过滤处理的低醇枣酒检测到34种香气物质。特有香气成分共有9种，其中2-甲基丁酸乙酯呈玫瑰香，丙酸异戊酯呈杏和菠萝香，十一酸乙酯呈椰子香[16-18]。另外，己酸乙酯(曲香、菠萝香)、苯甲酸乙酯(苹果味)、乙酸异戊酯(香蕉味)和十二酸乙酯(果香、花香)含量高。虽然特有香味成分种类多，但未检测到酸、酮、醛类风味物质，醇类物质含量也最低，可能会影响枣酒风味的协调性和肥厚感。

2.2.4 感官品质 由图6可知，3种工艺处理的低醇枣酒都具有浓郁的枣果香味，但发酵香存在显著差异，巴氏灭菌处理的低醇枣酒分值最低，而超声高频处理的低醇枣酒分值最高，可能因为超声高频处理丰富了枣酒发酵产生的酯类物质和醇类物质。从色泽上分析，超微过滤显示出更高的澄清度，巴氏处理澄清度最低。巴氏处理枣酒甜味最明显，余味、酸味、苦味分值最低，因而口感平衡度最差，甜味成为主要味道，并且有让人不愉悦的蒸煮味；超声高频和超微处理的低醇枣酒显示出同样水平的甜味，前者酸味、苦味和余味都稍微高于后者，在口感平衡度上显示出较高的优越性。综合几项指标，超声高频处理的枣酒除色泽得分居于中等外，口感平衡度和香味均为最佳。

图6 不同工艺终止发酵的低醇枣酒感官分析雷达图

3 结论

不同终止发酵工艺制作的低醇枣酒风味品质存在差异。巴氏灭菌终止发酵法得到的低醇枣酒有机酸含量偏低，甜味物质含量偏高，香气物质种类最少，因而甜味呈现主要味道，口感平衡度最差；高频超声处理制得的低醇枣酒酸味和甜味物质均衡，香气成分种类多，口感平衡度最佳；超微过滤处理制得的低醇枣酒酸味和甜味物质较均衡，香气物质种类最多但缺乏酸、酮、醛类和醇类物质。综合评比后得到，高频超声处理制得的低醇枣酒虽然可能不利于贮藏(乙酸含量高)，但各种风味物质的平衡度最好，香味成分种类丰富，且经济实用(超微过滤则需要消耗一次性膜，且膜较昂贵)，在3种终止发酵方式中最值得推荐。后续将研究不同终止发酵措施对酒体稳定性和货架期的影响。