KDM6A在髓系肿瘤中的病理作用和临床意义*

刘子祺，钱军

（江苏大学附属人民医院血液科，江苏 镇江 212000）

赖氨酸去甲基化酶6A（lysine demethylase 6A，KDM6A）在20多年前首次被发现，于2007年被鉴定为特异性组蛋白去甲基化酶［1］，能去除组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化（H3K27me3）修饰的抑制作用，对生理造血有重要意义。髓系肿瘤是骨髓内异常造血干祖细胞（hematopoietic stem and progenitor cell，HSPC）的克隆性增生。复发和耐药是多数患者总体预后较差的主要原因。KDM6A通过表观修饰作用调控关键基因和信号通路，从而影响髓系肿瘤的发生和预后。

1 KDM6A的结构和功能

KDM6A，也被称为X染色体上普遍转录的四三肽重复序列，其编码基因定位于性染色体Xp11.2，包含33个外显子。KDM6A在人体正常组织中广泛表达，由1 401个氨基酸残基构成不同的基序，其中在羧基端的催化基序——Jumonji C（JmjC）结构域赋予其H3K27me3的去甲基化活性，而在氨基端的调控基序——三十四肽重复（tetratricopeptide repeat，TPR）结构域帮助核定位，二者协同促进靶基因的转录及介导蛋白质相互作用［2-3］。作为KDM6亚家族的一员，KDM6A在人类中有2个旁系同源物：KDM6B和KDM6C。与KDM6A相比，KDM6B缺乏TPR结构域，其编码基因位于17p13.1；而KDM6C尽管拥有JmjC结构域，但去甲基化活性很低，其编码基因位于Yq11.221［3-4］。KDM6A通过去甲基化作用解除H3K27me3对基因转录的抑制，广泛促进干细胞增殖分化和组织器官发育，包括神经、心脏、肌肉及骨等［5-11］。

2 KDM6A在造血系统中的生理功能

KDM6A在骨髓、脾、胸腺及肝脏等主要造血器官中均表达［12］，提示其对机体造血很可能有重要作用。早期研究观察到，KDM6A敲减并不促进凋亡，但可使小鼠原代骨髓细胞的红系、巨核系和B细胞的集落形成减少，其机制主要是KDM6A敲减后RUNX1、MLL1和SCL启动子区KDM6A占有率下降，H3K27me3水 平显著增加［12］。其后研究显示，KDM6A促进HSPC增殖、迁移及分化，KDM6A敲减后小鼠造血祖细胞系32D细胞迁移能力下降，但整体H3K27me3水平并无变化，KDM6A敲除后小鼠原代HSPC迁移能力同样显著降低［13］。HSPC由造血内皮细胞通过内皮-造血细胞转化（endothelial-hemtopoietic transition，EHT）产生。研究证实，EHT过程依赖维生素C参与，维生素C致整体H3K27me3水平下降、并促进造血相关基因的染色质开放，而KDM6A在这一过程中发挥关键作用［14］。体外敲除KDM6A的HSPC出现分化相关基因CAR1/2、LYL1、SCL和GATA1以及肿瘤抑制因子BAX下调，下调基因多富集于造血谱系分化及免疫相关通路，如RPS14和IL2/STAT5通路，而PU.1上调，主要影响红系和巨核系的转录生成［13，15］。最新的研究表明，KDM6A可抑制B细胞分化，其敲除后边缘区B细胞增殖和浆细胞形成增加，促凋亡基因的H3K27me3水平升高、浆细胞凋亡减少［16］。然而，Huppertz等［17］认为KDM6A缺失致pro-B细胞向pre-B细胞分化受阻。近年的研究观察到KDM6A在维持造血稳态中发挥着重要作用，造血干细胞中KDM6A表达随年龄增长而下降，KDM6A敲除后HSPC衰老相关标志物表达增加，活性氧积累，DNA双链断裂修复受损，并且HSPC归巢和造血重建能力显著降低［18］。但Huppertz等［17］的研究则认为KDM6A缺失并不影响HSPC归巢，造血重建能力下降可能是HSPC增殖、分化或存活缺陷所致。此外，KDM6A对自然杀伤（natural killer，NK）细胞的功能有重要作用，敲除或抑制KDM6A后可减少促炎因子IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、IL-2和抗炎因子IL-10，同时改变NK细胞的炎症转录谱，包括周期、代谢和信号传导等通路，导致NK细胞在炎症功能中的降低［19］。

3 KDM6A在造血系统中的病理作用

3.1 KDM6A在急性髓系白血病（acute myelogenous leukemia，AML）中的作用最初对200例AML的肿瘤基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）研究及其后对1 540例AML的大规模研究均显示，AML患者存在着再现性KDM6A突变［20-21］。而对核心结合因子（core-binding factor，CBF）-AML的研究观察到KDM6A突变主要发生于RUNX1-RUNX1T1白血病患者［22］。其后，Greif等［23］对50例正常核型AML患者标本测序检测到2例患者在复发时出现KDM6A突变，均位于JmjC域，进一步研究观察到在白血病细胞株MM-6中也存在KDM6A基因外显子3～10纯合子缺失伴KDM6A表达缺失，赋予MM-6细胞对阿糖胞苷（arabinosylcytosine，AraC）的抗性；对临床数据的分析也显示细胞遗传学正常的AML（cytogenetically normal AML，CN-AML）患者初诊时KDM6A低表达可能是不良预后的一个预测因素。随后Stief等［24］对20例伴KDM6A突变AML的研究观察到多数突变位于TPR和JmjC结构域，65%患者存在移码插入/缺失或无义突变，提示功能丧失表型。8例患者在初诊时即有KDM6A突变；在12/20例患者中，突变仅发生在AML亚克隆细胞中，变异等位基因频率（variant allele frequency，VAF）低于15%。PDX模型证实携带E1325X突变的复发白血病细胞移植到免疫缺陷小鼠中可致KDM6A-E1325X突变克隆稳定再生；在未检出KDM6A突变的9例AML中出现4例复发时KDM6A蛋白表达显著下降、而3例患者复发时却呈上升态势；进一步对35例CN-AML的检测观察到45.7%患者KDM6A mRNA表达下调，而37.1%患者表达上调［24］。而Boila等［25］却检测到原代AML细胞和AML细胞系中KDM6A mRNA和蛋白表达均上调。这可能与病例构成不同有关。此外，也有研究观察到不管KDM6A表达如何，AML患者存在着KDM6A高甲基化改变，初诊时KDM6A高甲基化患者生存时间缩短［26］。

动物模型研究观察到，KDM6A条件性敲除后雌性小鼠脾脏重量明显增加，脾脏和骨髓中以髓系细胞为主，外周血白细胞不同程度增加，而血红蛋白和血小板则下降，63%的KDM6A-/-小鼠发展为AML，而KDM6A+/-小鼠和KDM6A+/+小鼠均无AML形成［27］。进一步研究证实KDM6A缺失使HSPC处于白血病前状态，HSPC显著扩增，粒细胞-单核细胞祖细胞和髓系祖细胞增加，而巨核细胞-红细胞祖细胞和淋巴祖细胞则显著减少；KDM6A缺失激活白血病发展过程中的致癌性ETS转录程序、并通过降低染色质的可及性和局部H3K27的乙酰化来下调GATA驱动的基因程序［27］。

此外，体内外研究证实，KDM6A突变致白血病细胞对AraC的抗性增加，而KDM6A敲减同样能够降低细胞对AraC和柔红霉素的敏感性，KDM6A重新表达则可恢复其敏感性。KDM6A缺失介导的AraC耐药是通过下调对细胞摄取核苷及其类似物具有重要作用的膜转运蛋白ENT1表达所致［24］。然而，有研究观察到，KDM6A与核小体重塑和脱乙酰酶相互作用，进而调节AML细胞中胞质分裂因子5/8（dedicator of cytokinesis 5/8，DOCK5/8）的表达，而针对DOCK的小分子抑制剂CPYPP可与DOCK同源区结构域结合并抑制DOCK家族蛋白的活性，进而抑制AML细胞活力，减弱AML细胞迁移，并诱导凋亡基因表达，而KDM6A缺乏则进一步使AML细胞对CPYPP抑制敏感［28］。这些结果提示KDM6A在AML中的作用可能存在着遗传学背景和时空背景下的特异性。

3.2 KDM6A在慢性髓系白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）中的作用CML是BCR-ABL融合基因所致的一种造血系统恶性疾病，酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）的广泛应用使得CML患者的预期寿命近于正常，但仍有2%～3%的患者对TKI治疗无反应并发生疾病进展，生存期只有7～11个月［29］。BCR-ABL1酪氨酸激酶区突变之外的其他基因突变在TKI治疗反应不佳中的作用已逐渐成为研究热点之一。最近，Adnan Awad等［29］在TKI疗效差的5例慢性期CML标本中检测到1例存在KDM6A-R1163P突变；其后对尝试TKI停药的47例CML患者的研究也观察到30例失去主要分子学反应，其中1例获得KDM6A-Q1058X突变［30］。尽管KDM6A敲除显著改变了K562细胞的组蛋白乙酰化和甲基化状态，但似乎并未影响K562细胞对伊马替尼、达沙替尼和普纳替尼的敏感性；并且，KDM6A敲除后K562细胞对NK细胞杀伤的敏感性降低，虽然KDM6A突变也存在于CML患者的NK细胞，但在NK细胞系NK-92中敲除KDM6A并未影响其对K562细胞的杀伤活性［30］。Zhang等［31］的研究认为，KDM6A在CML患者中表达上调，并且伊马替尼耐药的患者较治疗有反应者具有更高的KDM6A mRNA水平。与Adnan Awad等［29］的结果不同，Zhang等［31］观察到KDM6A敲减/敲除后K562和MEG-01细胞对伊马替尼诱导的凋亡更为敏感，并且KDM6A对于CML细胞在伊马替尼作用下的保护效应并不依赖BCR-ABL的表达或活性；进一步研究观察到KDM6A对CML细胞的保护作用也不依赖于其去甲基化酶活性，而是通过调节原肌球蛋白受体激酶A（tropomyosin receptor kinase A，TRKA）和神经营养受体酪氨酸激酶1（neurotrophic receptor tyrosine kinase 1，NTRK1）发挥作用，KDM6A被YY1招募到NTRK1增强子位点后，维持NTRK1的组蛋白乙酰化，并与YY1共同允许染色质的可及性，促进神经生长因子（nerve growth factor，NGF）/TRKA信号传导，从而保护CML细胞免受伊马替尼的影响。

3.3 KDM6A在慢性粒单核细胞白血病（chronic myelomonocytic leukoemia，CMML）中的作用CMML是一种具有骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）和骨髓增生性肿瘤（myeloproliferative neoplasm，MPN）重叠特征的克隆性造血干细胞疾病。由于其发病机制的复杂性，目前尚缺乏有效治疗。Jankowska等［32］首次在72名CMML患者队列中检测到7例（10%）存在KDM6A异常：6例突变（4例错义突变和2例无义突变）和1例缺失，更常见于晚期CMML（CMML-2和CMML-AML）中。对肿瘤体细胞突变目录数据库的检索结果显示，TP53是具有KDM6A突变的全部肿瘤患者中最常见的共突变基因（33.9%）；而在CMML、CMML-AML、AML和MDS患者中，KDM6A突变患者中TP53突变率也高于KDM6A未突变患者（分别为21.7%和6.7%）［33］。动物模型观察到，小鼠敲除KDM6A后出现CMML样表现：脾肿大，外周血单核细胞和粒细胞增多但原始细胞＜5%，同时红细胞和血小板减少，肝脾存在着单核细胞和粒细胞的髓外造血［33］。在具有CMML样表型的KDM6A敲除小鼠的造血干细胞和祖细胞中观察到TP53显著下调，表明TP53下调可能导致KDM6A缺失诱导的CMML样疾病［33］。该研究组进一步制备了KDM6A和TP53双敲除小鼠，TP53单双敲除小鼠死于T细胞淋巴瘤、肉瘤或畸胎瘤，中位生存期为6.2个月，而KDM6A和TP53双敲除小鼠在KDM6A缺失3个月后也出现脾肿大，外周血、骨髓、肝脾中髓细胞和粒细胞显著扩增，伴贫血和发育异常，外周原始细胞达5%～16%，并且小鼠寿命显著缩短，中位生存期仅3.8个月，表明TP53缺失可促进KDM6A缺失诱导的CMML［33］。进一步研究表明，KDM6A缺失导致造血干细胞自我更新增加，易向髓系分化［33］。

3.4 KDM6A在MDS中的作用一项包含738名MDS、CMML和MDS-MPN患者的大规模测序中检测到约2%的KDM6A突变［34］。近期对20例MDS患者的HSPC和间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）的下一代测序研究观察到，8例（40%）HSPC和8例（40%）MSC均存在低频KDM6A错义/无义突变，仅2例患者的HSPC和MSC共同存在KDM6A突变；但同一患者的HSPC和MSC中KDM6A突变位点并不相同［35］。在HSPC和MSC中，KDM6A突变分别与BCORL1和PDGFRA突变的相关性分析具有统计学意义（分别为P=0.012和P=0.05）［35］。该研究结果提示了MDS发病的异质性和复杂性。最近的动物模型观察到KDM6A条件性敲除雌性小鼠出现年龄依赖性的MDS样表型，KDM6A-/-小鼠出现轻度贫血、脾肿大及异常骨髓增生，包括双核和发育异常的红系前体和非典型巨核细胞的前体增加，随年龄增长更明显，但小鼠没有发展为明显的白血病，也未死于血细胞减少；竞争性移植小鼠模型也观察到KDM6A条件性敲除的骨髓细胞造血重建能力下降。此外，KDM6A缺陷基质可促进KDM6A敲除HSPC扩增［36］。去甲基化药物是高风险MDS（high-risk MDS，HRMDS）的标准治疗手段之一，但多数患者会耐药或复发。Polgarova等［37］对阿扎胞苷（azacitidine，AZA）治疗的38例HR-MDS患者的基因突变进行了动态监测，结果显示AZA治疗后VAF显著降低的患者获得了临床反应，而发生早期进展的患者突变改变极小；KDM6A突变患者总生存时间延长；但如在治疗过程中其VAF下降，反应持续时间反而缩短。

4 总结

KDM6A的表观修饰作用对生理造血有重要意义，尤其是在促进HSPC增殖分化以及维持造血系统稳态方面。对多种髓系肿瘤样本的测序均显示存在KDM6A突变且与患者预后不良相关，KDM6A敲除的动物模型也出现具有髓系恶性肿瘤特征的血液学变化。研究者进一步观察到KDM6A的作用辐射多条关键分子通路，作用机制包括去甲基化酶活性依赖性和非依赖性，且突变的KDM6A易与多个髓系肿瘤病程进展和预后相关基因共突变，继而诱导疾病发展，促使患者出现耐药和复发。临床对KDM6A的筛查及开发靶向药物有利于为患者制定更加精细化、个体化的治疗方案。