微小RNA-21在眼科疾病发生和发展中的作用

孙吉君 综述 阮庆国 史伟云 审校

1山东第一医科大学附属眼科研究所 山东第一医科大学附属眼科医院(山东省眼科医院)，济南 250021；2山东省眼科学重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，青岛 266071；3山东第一医科大学眼科学院，济南 250000

微小RNA(microRNA，miRNA)是长度约为22个核苷酸的非编码RNA，广泛存在于真核物种中，在RNA沉默和基因表达的转录后调控中起作用[1]。每个miRNA都能够调控几个,甚至几百个靶基因的表达，并参与胚胎发育、免疫反应、炎症、肿瘤发生以及细胞生长和增生等重要过程[2]。miR-21位于第17号染色体转膜蛋白49基因的第10号内含子上[3]，是较早发现的人类miRNA之一。研究表明miR-21作为抗凋亡基因在多种细胞类型中起作用[4-5]，目前已发现并证实的miR-21靶基因有几十种，其中很多与肿瘤的发生和发展有着密切关系，如程序性细胞死亡因子4(programmed cell death 4，PDCD4)抑制细胞生长，染色体10上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因(phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN)抑制细胞增生和迁移，B淋巴细胞瘤2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)抑制细胞凋亡，组织金属蛋白酶抑制因子3(tissue inhibitor of metalloproteinase 3，TIMP3)参与胞外信号引导细胞凋亡等[6]。miR-21通过调控上述靶基因，在细胞生长、代谢等病理生理过程尤其是肿瘤细胞增生、分化、凋亡、侵袭、转移等过程中发挥重要作用。最近的研究表明，miR-21可促进炎症反应，在免疫系统功能的调节中也起着关键作用[7]。虽然miR-21在非活化T细胞和抗原呈递细胞中维持低表达水平，但是这些细胞激活后miR-21的表达显著上调[8-10]。Ruan等[11]发现miR-21通过负调控其靶基因肿瘤坏死因子α诱导蛋白8类似蛋白2的表达,从而抑制活化T细胞的凋亡。miR-21可在角膜成纤维细胞、视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞、视网膜微血管内皮细胞(retinal microvascular endothelial cells，RMEC)等正常眼部细胞中表达；在疾病状态下，miR-21可在角膜移植排斥的角膜组织、碱烧伤后的角膜组织、视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)肿瘤组织、增生性玻璃体视网膜病变患者的玻璃体液、青光眼患者的房水和受损的小梁网细胞中表达。进一步研究表明，miR-21在众多眼科疾病的发生和发展中发挥重要的调控作用，并且靶向miR-21可能是预防或治疗多种眼科疾病的潜在方法。本文就miR-21在眼科疾病中的研究进展做一综述。

1 miR-21与角膜疾病

1.1 miR-21与角膜移植排斥

我国角膜盲患者约400万，角膜移植手术是这些盲人复明的重要手段，而术后免疫排斥反应是导致手术失败的最主要原因。Wang等[12]通过基因芯片分析发现，在异系小鼠角膜移植排斥组中miR-21表达较同系自体角膜移植组并无显著改变；但Lu等[13]通过对大鼠移植角膜深度测序发现，miR-21-5P在同系角膜移植中较正常角膜升高，miR-21-3P在异系角膜移植中表达高于同系角膜移植。我们认为结果不一致的原因主要是由于两者所采用的分析方法及研究动物种系不同，Wang等[12]采用miRCURY LNA阵列平台分析数据，Lu等[13]采用深度测序的方法以每百万转录数标准化各组miRNA的水平分析数据。可以看出Lu等[13]采用的检测及数据分析方法灵敏度更高，但是以上2种研究均未行角膜组织细胞分离，未研究miR-21在角膜上皮、基质、内皮细胞中的表达是否发生改变。可见，miR-21在角膜移植排斥中是否存在表达水平的改变及其作用、机制仍需进一步研究。

1.2 miR-21与角膜碱烧伤

眼化学性烧伤是由化学物品的溶液、粉尘或气体接触眼部所致，多发生在化工厂、实验室或施工场所，其中酸碱烧伤最为常见，是临床常见、处理棘手的眼外伤之一。近期研究发现，miR-21可以调控角膜碱烧伤后新生血管的形成。Zhang等[14]在小鼠碱烧伤动物模型中观察到miR-21在损伤后的角膜组织中表达显著增加，其表达与血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A)和缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)的mRNA及蛋白质表达水平呈显著正相关；并且，使用miR-21拮抗剂可以有效抑制角膜碱烧伤后VEGF-A和HIF-1α的表达；抑制miR-21可能通过Sprouty 2/4介导的磷酸化细胞外信号调节激酶失活改善角膜新生血管的形成。由此可见，靶向miR-21可能可以用来预防或治疗由角膜新生血管引起的视力丧失。

1.3 miR-21与颗粒状角膜营养不良2型

颗粒状角膜营养不良2型(granular corneal dystrophy type 2，GCD2)是由染色体5q31转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)诱导基因(TGFBI)中的点突变(R124H)引起的常染色体显性遗传病。研究发现miR-21与该病的发生相关。据报道miR-21是参与TGFBI调节的主要miRNA，可通过使TGFBI mRNA去稳定化负调节TGFBI蛋白水平，而TGFBI蛋白水平可影响GCD2表型[15]。虽然miRNA阵列实验显示野生型和GCD2纯合子角膜成纤维细胞之间的miR-21表达水平没有显著差异。但是，miR-21水平与角膜成纤维细胞中TGFBI的mRNA和蛋白水平呈正相关。TGF-β1诱导角膜成纤维细胞表达miR-21，miR-21可以通过靶向TGFBI的3'UTR下调TGFBI的基因表达。由此可见，miR-21和促进TGF-β信号传导的药物可能具有治疗TGFBI相关角膜营养不良的潜力。

2 miR-21与青光眼

青光眼是全世界第二位致盲性眼病，可导致永久性视神经损害，表现为视神经损伤、视野缺损、眼压升高或正常。近期研究发现miR-21在青光眼发病过程中起到重要作用。通过收集青光眼患者房水，行细胞外miRNA分析得出miR-21是青光眼患者中显著改变的miRNA，并且经H2O2处理后的小梁网细胞外液可检测到大量miR-21表达[16]。研究表明miR-21和Fas配体的表达之间存在负相关，Fas配体是外在(即线粒体外)细胞凋亡途径的主要激活因子。缺氧小胶质细胞激活后，Fas配体的过量产生诱导神经细胞凋亡，而miR-21的异位表达部分可保护神经元免受由缺氧激活的小胶质细胞引起的细胞死亡[17]。实际上，miR-21可抑制细胞凋亡[18]；而在青光眼发生期间，小梁网细胞可以通过Fas/FasL途径被刺激，进而引起细胞凋亡[19]。此外，miR-21的表达由活性氧物质诱导，并通过核因子κB和ERK 1/2信号通路抑制小胶质细胞活化[20-21]。因此，来自受损小梁网的miR-21释放可以被解释为旨在限制小梁网中的凋亡细胞损失和减弱神经胶质细胞活化的适应性反应，由此推测，miR-21的表达可延缓青光眼的进展。

Tan等[22]发现，原发性开角型青光眼(primary open-angle glaucoma，POAG)患者房水中miR-21-5P 的表达降低。进一步研究发现，miR-21-5P可以通过促进PTEN及内皮型一氧化氮合酶信号通路增加Schlemm管内皮细胞的通透性，促进房水流出；通过靶向SMAD7和FGF18以促进基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)9降解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)来降低眼压；通过抑制ras同源物基因家族成员B(ras homolog gene family member B，RhoB)调节Schlemm管内皮细胞的收缩性及抑制TIMP3调节ECM的更新促进房水流出，从而治疗POAG。

3 miR-21与眼底疾病

3.1 miR-21与增生性玻璃体视网膜病变

增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是视网膜表面发生的无血管、纤维细胞性的膜增生，是引起视网膜再脱离的主要原因。研究表明玻璃体中miR-21水平升高与视网膜纤维化相关[24]，RPE细胞的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在视网膜纤维化中起关键作用。Usui-Ouchi等[24]研究发现，miR-21在人RPE细胞中的表达是通过TGF-β诱导的，且在高葡萄糖培养条件下表达升高，表明miR-21表达与PVR的进展呈正相关。更进一步的增益和功能丧失研究结果表明，miR-21促进人RPE细胞株ARPE-19细胞的增生和迁移，而不影响EMT相关的基因表达。总之，miR-21参与视网膜纤维化的发展，并且可能成为PVR的新标记。

3.2 miR-21与糖尿病视网膜病变

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是指因高血糖导致眼组织的微血管发生病变，表现为毛细血管的周细胞坏死，随后内皮细胞变薄，内屏障功能受损，血管内的液体成分由管内渗出到组织中，最终造成视网膜病变和功能障碍。我国糖尿病患者中DR患病率为44.0%～41.3%，是50岁以上患者主要的致盲原因。

miR-21因参与调节视网膜新生血管的生成与此类疾病的发展相关。除了高糖培养下上调VEGF表达以外，miR-21可以在缺血缺氧环境中下调色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)的表达。有研究报道miR-21在缺血性视网膜病变的RPE细胞中表达增加，因为缺氧诱导的miR-21表达有助于增加视网膜内皮细胞中MMP2和MMP9活性，而缺血性视网膜中MMP2和MMP9活性的增加与PEDF蛋白水解降解有关。故而miR-21可以通过其阻断过氧化物酶体增殖激活受体α(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARα)表达的能力从而下调PEDF表达[25]。

由于视网膜血管内皮细胞对于血管生成是必需的，并且参与维持屏障选择性和血管的张力。Guduric-Fuchs等[26]通过牛RMEC深度测序发现，与内皮细胞相关的高表达miRNA中miR-21表达最多，miR-21抑制剂显著降低了RMEC的增生、迁移和血管形成能力。由此可以推测miR-21参与调节视网膜新生血管的生成。

进一步对缺氧条件下的人视网膜内皮细胞和氧诱导视网膜病变的研究表明，TIMP3是STAT3/miR-21途径的下游靶标，在氧诱导视网膜病变小鼠模型中，通过特异性反义阻断miR-21可以增加TIMP3表达从而抑制视网膜新生血管形成[27]。可见miR-21在缺血性视网膜病变中介导STAT3促血管生成作用，因此阻断其表达可作为防治视网膜新生血管的潜在方法。

此外，通过观察静息、促血管及抗血管生成条件下的人RMEC发现，促血管条件较静息条件miR-21表达下调[28]。Jiang等[29]研究发现DR患者外周血中miR-21含量与DR严重程度呈正相关。经高糖培养的ARPE-19细胞中可检测出miR-21的表达显著上调，同时肾素受体、VEGF和VEGFR2高表达，相关机制研究表明高葡萄糖诱导的miR-21通过ERK信号传导调节VEGF的表达[30]。过表达miR-21可能通过抑制PTEN的表达激活PI3K/Akt/VEGF信号通路，刺激DR大鼠的视网膜血管内皮细胞，促进新生血管生成[31]，这些发现对靶向miR-21在DR中调控新生血管生成具有重要意义。

miR-21除了参与DR新生血管的形成，还可以通过调控视网膜神经细胞凋亡影响DR的发生和发展。人RMEC体外研究表明高糖可以增加miR-21-5p、VEGF、VEGFR2的表达和细胞增生活性；抑制miR-21-5p可减少高葡萄糖诱导的人RMEC增生、迁移及血管形成，这些作用可能部分依赖于PI3K/AKT和ERK通路通过其靶蛋白maspin的调节[32]。此外，研究链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型发现，miR-21通过下调PDCD4可以促进糖尿病大鼠视网膜神经细胞凋亡，抑制miR-21可使视网膜神经细胞存活率显著增加，凋亡率显著降低[33]。

同样，Chen等[34]发现miR-21过表达、db/db小鼠(2型糖尿病模型)视网膜中PPARα水平降低，这种改变在棕榈酸处理的视网膜内皮细胞中同样存在，miR-21通过抑制PPARα的mRNA翻译来靶向PPARα。敲除miR-21可阻止PPARa减少，缓解微血管损伤，改善炎症，并减少db/db小鼠视网膜中的细胞凋亡。进一步研究表明，玻璃体腔注射miR-21抑制剂可减少PPARα下调，改善db/db糖尿病小鼠的视网膜炎。因此，DR患者外周血中miR-21的水平可以评估DR的严重程度，抑制miR-21可以作为DR的潜在治疗方法。

4 miR-21与视神经损伤

视神经损伤是不可逆视力损害的主要原因，甚至可致盲。星形胶质细胞过度活化不利于视神经损伤后视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell，RGC)的修复和恢复。对大鼠视神经损伤模型的研究表明，抑制miR-21减弱了星形胶质细胞的过度活化和胶质瘢痕形成，从而通过调节表皮生长因子受体途径促进轴突再生。抑制miR-21不仅可以增强轴突再生，还能促进视神经损伤大鼠模型中闪光视觉诱发电位的功能恢复[35]。同样，Li等[36]的研究揭示了抑制miR-21可通过调节大鼠视神经损伤后Müller胶质细胞增生，促进RGC存活、视网膜神经纤维层增厚和RGC功能的恢复。因此，抑制miR-21可用于视神经损伤的治疗。

但是，在氧葡萄糖剥夺和黄芪甲苷处理的RGC细胞株RGC-5中miR-21的表达显著上调，上调的miR-21激活PTEN-PI3K/AKT和Wnt/β-catenin信号传导途径，减少RGC-5细胞损伤，提示黄芪甲苷或许可以通过高表达miR-21来治疗视神经损伤[37]。miR-21调控RGC存活不一致的原因可能有以下2个：(1)所研究的细胞种类不同，一类是视神经损伤模型的体内研究，另一类是细胞株的体外研究；(2)刺激的条件不一样，一类是诱导的视神经损伤模型，细胞处在复杂的炎症微环境中；另一类是氧葡萄糖剥夺下使用黄芪甲苷单一因素处理细胞。而且目前对于RGC-5细胞株存在争议，部分研究者认为此细胞株是小鼠的光受体细胞系，不能代表RGC。可见，关于miR-21对RGC存活的调控需要进一步系统的探讨，为miR-21用于人视神经损伤性疾病的治疗提供理论依据。

5 miR-21与眼部肿瘤

5.1 miR-21与RB

RB是由2个等位基因(Rb1基因)上的突变引起的儿童眼部疾病。Rb1和其他相关基因可以通过miRNA与其靶点互补配对来调节。miR-21具有靶向几种肿瘤抑制基因(包括PDCD4)的致癌潜力，并调节肿瘤进展和转移[38]。

已有研究发现，RB组织样本及RB细胞系HXO-RB44细胞中miR-21的水平高于视网膜正常组织中的表达，抗miR-21在体外通过下调的磷酸化信号传导途径导致RB细胞增生、迁移和集落形成显著抑制[39]。在RB细胞系Weri-Rb-1细胞中，miR-21抑制剂可以抑制肿瘤细胞活力，通过调节PDCD4、Bax和Bcl-2的水平来增加肿瘤细胞凋亡率[40]。同时，通过抑制MMP2和MMP9的蛋白水平抑制肿瘤细胞迁移和侵袭，并显著影响PTEN、PI3K和p-AKT的表达，表明miR-21抑制剂通过PTEN/PI3K/AKT信号途径抑制肿瘤细胞增生、迁移和侵袭。可见，靶向miR-21能够通过多种途径抑制RB进展，可以作为RB的治疗靶点。

5.2 miR-21与葡萄膜肿瘤

葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma，UM)是成人常见的眼内恶性肿瘤，起源于虹膜、睫状体或脉络膜中的黑色素细胞。近期研究发现，在UM患者血清及瘤体组织中miR-21-5p显著上调，并且其可能通过抑制P53基因并增加LIM和SH3蛋白1的表达来促进肿瘤细胞的增生及转移[41-42]。

6 miR-21与葡萄膜炎

葡萄膜炎是虹膜、睫状体及脉络膜组织炎症的总称，广义上还包括葡萄膜、视网膜、视网膜血管、玻璃体的炎症，是主要的致盲原因之一。研究发现miR-21与葡萄膜炎的发生相关。Ishida等[43]在实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis，EAU)小鼠模型中通过miRCURY LNA阵列平台发现miR-21表达显著上调；实时荧光定量PCR结果显示，去除角膜及晶状体的眼组织细胞中，miR-21于建模后第7天开始上调，至建模第21天表达水平最高，至建模第28天仍维持较高水平。Hsu等[44]在实验性自身免疫性前葡萄膜炎大鼠模型中发现miR-21在虹膜睫状体中表达，其表达水平至建模第10天先升高而后下降，至建模第25天显著降低；Watanabe等[45]在EAU大鼠模型中发现建模第14天及第21天miR-21在视网膜中表达升高。同期，Rossi等[46]发现在内毒素诱导的大鼠葡萄膜炎模型中，使用消退素1联合脂多糖玻璃体腔注射较单纯脂多糖玻璃体腔注射诱导的大鼠模型B和T淋巴细胞减少，miR-21表达上调。此外，Choi等[47]发现miR-21在白塞病患者外周血中表达上调，且在单纯疱疹病毒诱导的白塞病小鼠模型中，miR-21在淋巴结中表达上调。实验中使用药物降低miR-21表达水平可以改善白塞病小鼠的症状，抑制miR-21不仅导致血清IL-17和IL-6水平下调，PDCD4、RhoB、程序性死亡受体1、IL-12p35和Toll样受体4的表达水平也受调节而发生变化，但是葡萄膜炎发病情况及变化此研究并未见报道。此外，研究发现，miR-21可促进Th17细胞分化，在免疫调控中发挥重要作用。Th17细胞分化在EAU的发生和发展中起重要作用[48]，并且miR-21在疾病中表达显著上调，但对于miR-21是否通过促进Th17细胞分化调控EAU的发生和发展尚不明确，目前我们正在利用miR-21缺失的小鼠进行相关研究。

7 miR-21与其他眼科疾病

近年来，外泌体作为信号分子调节细胞状态与功能成为研究热点。Morris等[49]研究发现，RPE细胞外泌体介导的miR-21转移入小胶质细胞影响了p53通路下游基因的表达，有助于调节衰老视网膜中的小胶质细胞功能，这一信号传递方式可能是RPE细胞衰老过程中与慢性炎症相关的信号传递机制，可见靶向miR-21有望治疗年龄相关性黄斑变性。

Deng等[50]近期研究发现，间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)外泌体中的miR-21通过靶向PDCD4对N-甲基-N-亚硝基脲诱导的感光细胞凋亡和视网膜功能障碍有治疗作用，可以治疗视网膜变性[50]。

另外，Zhang等[51]研究发现，过表达miR-21或抑制Sprouty2降低了细胞角蛋白(cytokeratin，CK)-3和CK-12的水平并促进了角膜上皮细胞的EMT，从而促进角膜上皮损伤修复；Liu等[52]进一步研究发现，人脐带MSC衍生的小细胞外囊泡可以通过转移miR-21抑制PTEN来促进角膜上皮伤口的恢复，提示miR-21可成为一种新的角膜伤口修复治疗剂。

虽然miR-21眼部相关研究近年来已取得一定成果，然而仍有很多问题尚未解决，譬如miR-21与许多眼科疾病具有一定的相关性，其可否用于这些疾病的早期诊断仍需进一步探讨；又如目前的许多研究都局限于细胞株，miR-21在原代细胞、眼科疾病模型的炎症微环境下是否存在不同的作用仍需进一步研究；再如除RB和葡萄膜肿瘤外，miR-21是否参与其他眼科肿瘤的发生和发展等。相信随着对miR-21研究的不断深入，将为以后靶向miR-21治疗眼科相关疾病提供更详尽的理论依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突