非洲辣木组培快繁再生技术体系的建立

钟连香，林 东，魏秋兰，肖玉菲，刘海龙，覃子海

（广西壮族自治区林业科学研究院，广西南宁 530002）

非洲辣木（Moringa stenopetala）为辣木科（Mor⁃ingaceae）辣木属植物，有丰富的营养和药用价值[1]，在热带、亚热带国家和地区分布广泛，在我国云南、广东及广西等地有大量种植[2]；辣木籽富含氨基酸、蛋白质、维生素及人体必需的矿物质元素，有较高的营养价值[3]；含有黄酮、多糖和多酚等生物活性物质，在抗氧化、消炎、抗癌和降血压等方面作用显著[4-5]，是药食同源的植物，其营养和药用价值已被广泛证实并开发利用[6-7]。辣木（M. oleifera）具有速生、耐旱和抗病性强等特点，经济效益好，是世界上热门的多用途树种之一[8]，同属的非洲辣木也具有这些特点。关于辣木化学成分的药理作用和营养成分方面的研究均取得了较好的进展[9-10]。基于辣木的潜在价值，并且辣木种子价格较高，传统的种子育苗已不能满足市场需求，辣木育苗技术[11]和栽培技术[12]日益成为研究热点。关于辣木组织培养技术方面的研究也逐渐增多。陈丽文等[13]研究发现，辣木在MS + 6-BA 0.6 mg/L + IAA 0.2 mg/L 培养基上，培养增殖系数可达4.2，但在培养过程中出现叶子黄化脱落的现象；高敏霞等[14]的研究结果显示，辣木的生根率可达80%，其生根培养基仍需继续优化；张天翔等[15]的研究表明，辣木生根瓶苗移栽在泥炭土∶珍珠岩=1∶1 的基质中，成活率为80.6%。目前，非洲辣木组织培养技术尚不成熟，有必要对其开展无性快繁技术研究，摸索成熟的组培快繁体系，为非洲辣木推广提供优质的种质资源。本研究以非洲辣木无菌苗为试验材料，研究培养基和植物生长调节剂对其再生体系建立的影响，探索最适移栽基质，优化非洲辣木组培快繁再生技术，加快良种推广应用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用材料为非洲辣木无菌苗。无菌苗由饱满且健康的非洲辣木种子经无菌萌发获得，种子原产于印度。

1.2 试验方法

1.2.1 无菌苗诱导

将种子剥去外壳并用洗衣粉洗净，置于超净工作台上消毒（75%酒精1 min + 0.1%升汞10 min）。将经消毒处理和无菌水冲洗后的种子接种于MS 培养基（蔗糖30 g/L，琼脂6 g/L，pH 值6.0）上，放在培养架上培养。15 天时，统计发芽情况，计算发芽率（%）和污染率（%）。

1.2.2 愈伤组织诱导

采用6-BA 和KT 的组合进行愈伤组织诱导，基本培 养基 为MS 培 养基。6-BA 浓 度为0.1、1.0 和2.0 mg/L，KT 浓度为1.0 和2.0 mg/L，共6 个处理（表1）。将无菌苗切成2 ～2.5 cm 小段，接种至愈伤组织诱导培养基上。15 天后，统计出愈数，计算诱导率（%）。

1.2.3 继代增殖培养

对诱导产生的不定芽进行切断处理，保留2 cm左右的长度，以基本培养基（MS、WPM 和B5）、6-BA（0.2、0.6和1.2 mg/L）和KT（0.1、0.3和0.5 mg/L）为因素，进行L9（34）正交试验设计（表2）。接种后，先暗培养10 天，再转入正常光照培养。25 天后，统计各处理芽总数，计算增殖系数。

1.2.4 生根培养与移栽

以基本培养基（1/2 MS、1/2 WPM 和1/2 B5）、NAA（0.5、1.0 和1.5 mg/L）和IBA（0.5、1.0 和1.5 mg/L）为因素，进行L9（34）正交试验设计（表3）。将增殖培养得到的小苗接种至培养基；接种后，用遮光布遮住进行暗培养，7 天后将遮光布掀开进行全光照培养；25 天后，统计苗木生根状况，计算生根率（%）。将生根的试管苗移入大棚，在自然光下炼苗7天后，将生长健壮的生根苗分别移栽至椰糠、泥炭土、泥炭土∶椰糠= 1∶1、泥炭土∶椰糠= 1∶3 和泥炭土∶椰糠=3∶1 这5 种基质中。移栽30 天后，统计生长状况，计算移栽成活率（%）。

1.3 培养条件

培养温度为24 ℃，光照强度为6 000 lx，光周期为14 h/天。

1.4 数据处理

采用Excel 2016 软件进行数据整理；采用SPSS 21.0 软件对诱导率、增殖系数、生根率、生根数和根长进行方差分析和邓肯氏新复极差检验。

2 结果与分析

2.1 无菌苗诱导情况

培养7 天后，种子开始萌动；15 天时，种子发芽率为81.11%，污染率为17.41%。

2.2 不同处理对愈伤组织诱导的影响

培养10 天后，开始出现少量愈伤组织。6 个处理的诱导率均在50%以上，处理3 和处理5 的诱导率达80%以上；处理3的诱导率最高（89.89%），显著高于其他处理（P＜0.05）（表1）。6-BA 浓度为0.1 mg/L 时，随KT 浓度升高，诱导率增加；6-BA 浓度为1.0 或2.0 mg/L 时，随KT 浓度升高，诱导率降低。处理3 的诱导率高且愈伤组织生长较好，非洲辣木愈伤组织诱导的最适培养基为MS + 6-BA 1.0 mg/L +KT 1.0 mg/L。

表1 不同处理对愈伤组织诱导的影响Tab.1 Effects of different treatments on callus induction

2.3 不同处理对继代增殖的影响

以MS 为基本培养基的处理更有利于继代增殖，以WPM 和B5 为基本培养基处理的增殖效果较差（表2）。处理1 和处理2 的增殖系数均达4.0 以上，显著高于其他处理（P＜0.05）；影响增殖系数的因素为培养基＞6-BA ＞KT。处理2 的增殖系数最高（4.62），非洲辣木不定芽增殖的最优培养基为MS+6-BA 0.6 mg/L+KT 0.3 mg/L。

表2 不同处理对继代增殖的影响Tab.2 Effects of different treatments on subculture proliferation

2.4 不同处理对生根的影响

生根培养10 天后，小苗的基部切口处开始生根。各处理的生根率均在60%以上；处理6 的生根率最低（63.80%），显著低于其他处理（P＜0.05）；处理1 和处理2 的生根率较高，均在94%以上；影响生根率的因素为NAA ＞培养基＞IBA（表3 ～4）。各处理的根长为1.38 ～2.18 cm，以1/2 WPM 为基本培养基处理的根长较短；影响根长的因素为培养基＞IBA ＞NAA。各处理的生根数均在3 根以上，处理1和处理7 的生根数较多，在6 根以上；以1/2 MS 和1/2 B5 为基本培养基处理的生根数较多；影响生根数的因素为培养基＞NAA ＞IBA。处理2 的生根率最高（96.67%），根长和生根数均表现较好，非洲辣木生根的最优培养基为1/2 MS + NAA 1.0 mg/L +IBA 1.0 mg/L。

表3 不同处理对生根的影响Tab.3 Effect of different treatments on rooting

2.5 不同基质对幼苗移栽的影响

在不同移栽基质中，幼苗的存活率均在80%以上；处理2 的存活率最高（94.44%）；处理5 次之（92.22%）；处理1 和处理4 的存活率较低，显著低于其他处理（P＜0.05）（表5）。处理2的苗木存活率高且生长较好，泥炭土为最适合的移栽基质。

表5 不同移栽基质对幼苗存活率的影响Tab.5 Effects of different transplanting substrates on survival rates of seedlings

表4 不同因素的极差分析Tab.4 Range analysis on different factors

3 讨论与结论

消毒是植物组织培养的关键环节[16]。处理方式、消毒试剂及消毒时间均会影响种子萌发。研究结果表明，非洲辣木种子经剥壳、清水中浸泡30 min + 75%酒精消毒1 min + 0.1%的升汞消毒10 min 处理后，消毒效果较好，种子发芽率较高，污染率较低。辣木外壳表面细菌多，剥除外壳结合消毒处理，可有效减少污染，提高发芽率。

培养基在继代增殖过程中发挥重要作用。研究结果显示，非洲辣木在以MS 为基本培养基的处理上增殖效果较好，与刘德承[17]的研究结果一致。MS 培养基中较高浓度的NH4+和NO3

-更适合非洲辣木不定芽的增殖。基本培养基只能使外植体存活下来，想要获得更优质的试管苗，需添加植物生长调节剂促使其生长和分化。本研究在非洲辣木愈伤组织诱导和继代增殖阶段选用的植物生长调节剂为6-BA 和KT。相关研究表明，6-BA 浓度为0.5 ～1.2 mg/L 时，浓度与愈伤组织生长呈正相关[18]；6-BA 浓度为0.02 ～1.0 mg/L 时，随浓度升高，愈伤组织生长增加[19]。本研究结果显示，在非洲辣木愈伤组织诱导试验中，KT 浓度为1.0 mg/L 时，随6-BA浓度升高，诱导率先升后降，1.0 mg/L 时最高，与之前的研究结果基本一致。在诱导培养基中添加适量的KT 可改善愈伤组织的质量，延缓其器官分化能力的丧失，提高植株再生频率[20]。本试验结果显示，6-BA 浓度为0.1 mg/L 时，KT 浓度的增加有利于愈伤组织诱导；6-BA 浓度为1.0 或2.0 mg/L时，愈伤组织诱导率与KT 浓度间存在“低促高抑”的现象，调节各植物生长调节剂的配比尤为重要。在继代增殖过程中，培养基与植物生长调节剂间的相互作用共同影响非洲辣木的增殖。非洲辣木继代增殖的最适培养基为MS 培养基；以MS 为基本培养基时，增殖系数随6-BA 和KT 浓度的增加先增后降，6-BA 浓度为0.6 mg/L、KT 浓度为0.3 mg/L 时，增殖系数可达4.62，增殖效果最佳。

木本植物生根是离体培养的关键步骤[21]，培养基种类和植物生长调节剂等对组培苗生根均会产生一定影响。非洲辣木在无机盐浓度较低的1/2 MS培养基上生根效果较好，高浓度无机盐易使外植体切面产生愈伤组织，不利于生根。试管苗生根多属于不定根，根原基不是植物体内固有的，而是在植物生长调节剂等因素作用下形成的，添加外源植物生长调节剂有利于不定根形成[22]。NAA 和IBA 是诱导不定根形成的常用植物生长调节剂，其不同浓度配比会对植物生根产生不同影响，因此需要调节各植物生长调节剂的配比，在保证生根的情况下，让根多且粗壮，利于移栽成活。本试验结果显示，以1/2 MS 为基本培养基，NAA 为1.0 mg/L、IBA 为1.0 mg/L 时，非洲辣木生根率最高，生根数较多，根细长且愈伤组织少，利于苗木移栽成活。

移栽基质与移栽成活率和生长状况密切相关[23]。本研究中，以泥炭土作为移栽基质，非洲辣木的移栽成活率高达94.44%，可能是因为泥炭土持水性和透气性好，能减少水分流失，同时其腐殖质丰富，能为苗木生长提供足够的养分。

非洲辣木种子经过剥壳处理，经清水浸泡30 min+75%酒精消毒1 min+0.1%升汞消毒10 min处理后，可达到很好的发芽效果；愈伤组织诱导最佳培养基为MS + 6-BA 1.0 mg/L + KT 1.0 mg/L，诱导率为89.89%；继代增殖最佳培养基为MS+6-BA 0.6 mg/L + KT 0.3 mg/L，增殖系数为4.62；生根最佳培养基为1/2 MS+NAA 1.0 mg/L+IBA 1.0 mg/L，生根率为96.67%；以泥炭土作为移栽基质，能显著提高试管苗的移栽成活率。综合来看，在本研究建立的组培快繁技术体系下，非洲辣木外植体诱导、继代增殖、生根培养及炼苗移栽效果理想，该技术体系可在工厂化育苗中推广应用，可为非洲辣木快速繁殖和缓解种苗短缺提供保障。