不同人参栽培土壤养分及微生物群落组成特征解析

王 岩，王丽伟，赵洪颜，赵 敏，杨洪岩

（1东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040；2黑龙江省酶与类酶工程重点实验室，哈尔滨 150040；3延边大学农学院，吉林延吉 133000）

0 引言

人参是中国传统名贵中药材，中国作为世界上最早开展人参栽培的国家，现今栽培面积和产量位居世界首位，产量约占世界总产量的70%[1]，其作用及经济地位不容忽视。以往的人参栽培以伐林栽参为主，这种栽培方式破坏栽培区域林地植被系统，严重危及林区生态安全，已被严令禁止，人参种植产业已向优质农田栽参方向转移[2]。普通农田栽参存在土壤自然养分低、有益微生物少、病害严重等问题[3]。如何重建土壤微生态系统，促进微生物群落正向演替，防治土传病害等是农田栽参亟待解决的科学和技术问题。深入解析农田栽参土壤性质、不断优化种植方案对促进人参产业发展具有重要的理论及现实意义。

人参生长要求所栽植的土地肥沃、养分充足，这也是林地土壤适合栽植人参的主要原因。相比之下，已经栽植并收获的人参土壤俗称老参地，由于连作病害多、理化性质恶化等原因，栽过一茬的人参土壤要30年后才能再栽参[4]。应用农田土壤进行栽参一般需经过1年左右的土壤修整及改良，目前的改良主要从土壤消毒和施肥改土两方面进行。在氯化苦土壤消毒和绿肥回田的改良措施下，农田的土壤微生态环境得到改善，为人参创建了良好的实际生长环境，可保证农田栽参工作的顺利发展[5]。将稻壳炭或玉米秸秆炭作为土壤调理剂可显著促进连作人参种苗生长，其生长量的增加与生物质炭对老参地土壤的改良密切相关[6]。有机肥改良剂也可以改善土壤理化性质、微生物群落组成、多样性和功能[7]。孙海等[8]研究发现合理施用多功能微生物制剂能够改善农田栽参土壤养分状况，有效提高土壤养分供应能力。虽然已经做过多种土壤改良尝试，但农田土壤改良仍然依据不足，主要体现在参农按经验种植经常导致的农药、化肥的不合理使用，继而造成资源的浪费、成本的提高和环境的污染[9]。问题解决的关键点之一是需厘清不同类型土壤如农田土壤、林地土壤和老参地土壤在养分及微生物学特性方面的差异。基于此，本研究以林地、农田、老参地土壤为研究对象，研究3种类型土壤在土壤养分和微生物学特性方面的差异，以期为农田栽参土壤的定向改良提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集及处理

土壤样品采样地点分别为敦化市秋梨沟镇松树林(128°07′E，43°27′N)、敦化市黄泥河镇玉米田(128°02′E，43°32′N)和敦化市黄泥河镇4年生人参采收后土地(128°02′E，43°32′N)。在每个地点按蛇形采样法选取4个点，取0～20 cm层土壤，同一样地土壤全部样品充分混匀即为该点土壤样品。将鲜土样品分为2份，其中一份于室内自然风干，过2 mm筛后室温保存，用于各项土壤理化性质的测定；另一份鲜土样品于-80℃冰箱中保存，用于土壤高通量测序。

1.2 土壤养分测定

土壤pH测定采用pH法；硝态氮和铵态氮采用2 mol/L KCl浸提-分光光度法测定；有效磷采用NaHCO3浸提-钼锑抗分光光度法测定；全氮测定采用凯氏定氮法[10]；全磷采用氢氧化钠碱熔-钼锑抗分光光度法测定；全钾采用火焰原子吸收分光光度法测定；土壤有机质含量采用灼烧法测定[11]。

1.3 DNA提取及高通量测序

使用QIAGEN土壤DNA提取试剂盒(QIAGEN，USA)提取3种类型的土壤样品。使用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的土壤DNA样品，采用Nanodrop 2000(Thermo，USA)测定DNA浓度。将提取的土壤样品DNA委托上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序。

细菌利用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)引物扩增16S V3-V4区建库，真菌采用ITS1(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和 ITS2(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)引物扩增 ITS1 区建库。上机测序后数据经过滤、拼接，随后进行数据库比对、物种注释；在97%的相似水平下对所有序列进行OTU划分，对OTU的代表序列作分类学分析。

1.4 数据分析

土壤养分数据采用SPSS 19.0进行单因素方差分析，显著性水平P＜0.05。高通量测序列数据于美吉生物云平台(www.majorbio.com)进行处理。采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并在各个分类水平统计各样本的群落物种组成。细菌16S rRNA对比数据库为Silva(Release 132 http://www.arb-silva.de)真菌ITS对比数据库为Unite(Release 7.2 http://unite.ut.ee/index.php)。选择97%相似度的OTU，利用mothur计算各样本的Alpha多样性(version v.1.30.1 http://www.mothur.org/wiki/Schloss_SOP#Alpha_diversity)。利用Circos-0.67-7(http://circos.ca/)绘制可视化圈图来描述样本与物种之间对应关系。群落柱形图、PCoA图、组间差异显著性检验、db-RDA分析及环境因子与物种相关性均应用R语言进行统计分析与作图(R version 4.0.3)。

2 结果与分析

2.1 不同类型土壤养分含量分析

由表1可知，不同类型土壤的pH存在显著差异(P＜0.05)，其中林地土壤的pH最高，4年参地土壤的pH最低。在3种类型土壤中，硝态氮含量为农田＞林地＞4年参地(P＜0.05)，而铵态氮含量在不同土壤中呈现相反的趋势。4年参地土壤中有效磷含量远高于林地与农田。土壤全氮与有机质含量在3种土壤中存在显著差异，且4年参地中含量最高。4年参地土壤的全磷显著高于其他(P＜0.05)，不同类型土壤中全钾含量无显著差异。

表1 不同类型土壤养分含量分析

2.2 不同类型土壤微生物群落Alpha多样性分析

表2显示了样本微生物群落的Alpha多样性指数，Coverage指数均大于98%，说明样品中基因序列被检出的概率很高，取样合理，能够真实地反映土壤样本的微生物群落。其中，不同样本中微生物群落的ACE和Chao 1指数差异显著，说明不同土壤中细菌及真菌群落的丰富度存在显著差异，表现为林地＞农田＞4年参地。与细菌相比，真菌的Simpson和Shannon指数均存在显著差异，表明在不同类型土壤中真菌群落多样性差异显著，表现为林地＞农田＞4年参地。

表2 微生物群落多样性指数表

2.3 不同类型土壤细菌群落结构特征

在不同类型土壤中细菌门水平的群落结构基本一致，如图1a所示，主要分布在11个细菌门分别包括Proteobacteria、 Acidobacteriota、 Actinobacteriota、Chloroflexi、 Gemmatimonadota、 Patescibacteria、Bacteroidota、 Myxococcota、 Verrucomicrobiota、Methylomirabilota、Firmicutes、WPS-2和Nitrospirota，3种类型土壤共同的优势菌门为Proteobacteria、Acidobacteriota、 Actinobacteriota、 Chloroflexi、Gemmatimonadota、 Patescibacteria、 Bacteroidota、Myxococcota、Verrucomicrobiota和Firmicutes。

在4年参地土壤中，Proteobacteria、Patescibacteria和Bacteroidota的丰度分别为40.41%、10.73%和5.48%，显著高于其他2种土壤类型(P＜0.05)。Acidobacteriota是林地土壤中相对丰度最大的细菌门类，其占比为38.06%，显著高于另外两组土壤。相较于林地与 4年参地，Actinobacteriota、Chloroflexi和Gemmatimonadota在农田土壤中占有更高的百分比，分别为14.42%、16.21%和7.06%。

对相对丰度大于1%的细菌目构建可视化圈图（图1b），Burkholderiales和Acidobacteriales在林地土壤中含量较高，相对丰度分别为12%和15%，显著高于农田与4年参地土壤。就Xanthomonadales在不同类型土壤中的分布而言，4年参地中分布比例占74%，显著高于另外两种土壤类型。

图1 细菌群落相对丰度与可视化圈图

为明确3种类型土壤间细菌群落的差异，对3种类型土壤的9个样本进行主坐标分析[(PCoA)，图2a]结果表明，第1主坐标轴(PCA1)和第2主坐标轴(PCA2)对样本组成差异的解释度分别为65.54%和25.59%，2个主坐标轴累积解释度达到91.13%，说明其能够表征微生物群落组成的特征。3组样品在PC1轴明显分开，农田组与林地和4年参地组在PC2轴明显分开，说明3种类型土壤中细菌微生物群落结构存在显著差异。

图2 不同类型土壤细菌(a)和真菌(b)群落主坐标分析(PCoA)

2.4 不同类型土壤真菌群落结构特征

在门水平上，如图3a所示，除少数真菌未被分类外，3种类型土壤真菌主要分布于5个真菌门，即Ascomycota、 Mortierellomycota、 Basidiomycota、Rozellomycota和 Chytridiomycota。Ascomycota在各组中均占有最高的相对丰度(47.47%～79.18%)，Mortierellomycota在不同类型土壤中所占比例为林地＞农田＞4年参地。不同土壤真菌类群在属水平存在较大差异（图3b），Mortierella为林地土壤中的优势菌属，相对丰度为39.21%，显著高于农田土壤(26.27%)和4年参地土壤(13.09%)。Fusarium在农田土壤中的相对丰度最高(22.72%)。Helotiaceae，Plectosphaerella和Penicillium在4年参地中的相对丰度显著高于林地与农田(P＜0.05)；Sclerotinia只在4年参地中检测到，其相对丰度为11.29%。

图3 真菌群落相对丰度与组间差异显著性

对3种类型土壤的9个样本真菌群落的PCoA分析如图2b所示，PCA1和PCA2对样本组成差异的解释度分别为62.11%和36.03%，2个主坐标轴累积解释度达到98.14%。3组样品在PC2轴明显分开，4年参地组与林地和农田组在PC1轴明显分开，说明3种类型土壤中真菌微生物群落结构存在显著差异。

2.5 环境因子对土壤微生物群落组成的影响

为进一步研究三种类型土壤微生物群落组成与环境因子的关系，采用基于Bray-Curtis距离的db-RDA分析方法对土壤理化性质与土壤微生物群落的关系进行研究，探寻影响土壤微生物群落组成的驱动因子。如图4所示，pH、铵态氮、硝态氮、有效磷、全氮、全磷和有机质含量对微生物群落结构影响最大。铵态氮、有效磷、全氮、全磷和有机质之间夹角为锐角，与pH的夹角为钝角，表明这几种环境因子间存在正相关关系，但与pH呈负相关关系。其中，铵态氮、有效磷和全磷对农田土壤的细菌及真菌群落结构存在较大的正相关关系。

图4 微生物群落与环境因子的db-RDA分析

2.6 细菌目相对丰度与土壤养分的相关性

选取细菌目水平总丰度前20的物种，采用Spearman相关性系数，评估其与土壤养分间的相关性。由图5a可知，pH和有效磷含量是影响细菌群落最主要的因子。Xanthomonadales、Saccharimonadales和Sphingomonadales与pH呈显著负相关关系(P＜0.05)；Acidobacteriales、 Bryobacterales、 Burkholderiales、Rokubacteriales、Solibacterales、Subgroup_2、Subgroup_7和Vicinamibacterales与pH呈显著正相关且与土壤有效磷含量呈显著负相关(P＜0.05)。Xanthomonadales、Saccharimonadales、Sphingomonadales和Micropepsales与有效磷含量呈显著正相关(P＜0.05)。Bryobacterales、Burkholderiales和Solibacterales与土壤全磷含量呈显著负相关。Chitinophagales与土壤铵态氮，全氮及有机质含量呈显著正相关(P＜0.05)，与土壤铵态氮含量呈极显著负相关关系(P＜0.01)。

2.7 真菌属相对丰度与土壤养分的相关性

选取真菌属水平总丰度前20的物种，采用Spearman相关性系数，评估其与土壤养分间的相关性。由图5b可知，pH、铵态氮、硝态氮、有效磷、全氮、全磷和有机质含量是影响真菌群落最主要的因子。Articulospora、 Epicoccum、 Mortierella、 Pezizella、Rodwayella和Ascomycota与pH呈显著正相关，与土壤有效磷含量呈显著负相关(P＜0.05)；而Penicillium和Helotiaceae与pH呈显著负相关，与土壤有效磷含量呈显 著 正 相 关 关 系 (P＜0.05)。 Cladosporium、Plectosphaerella和Vishniacozyma均与土壤铵态氮、全氮、全磷及有机质含量呈显著正相关，与土壤硝态氮含量 呈 显 著 负 相 关 (P＜0.05)。 Dothideomycetes 和Helotiaceae均与土壤铵态氮、全氮、全磷及有机质含量呈显著负相关，与土壤硝态氮含量呈显著正相关(P＜0.05)。Didymella与土壤铵态氮、全氮及有机质含量呈显著负相关，与土壤硝态氮含量呈显著正相关。Sclerotinia与pH和土壤硝态氮呈显著负相关，与土壤铵态氮、有效磷、全氮、全磷和有机质含量呈显著正相关。

图5 微生物与环境因子间相关性热图

3 结论

本研究比较了同一区域林地土壤、农田土壤和4年生参地土壤的养分含量及微生物组成，即以人参最适种植土壤、需改造土壤和不适宜种植土壤为研究对象，进行土壤养分和微生物群落分析。土壤养分分析结果显示，不同类型土壤中养分除全钾外，均存在显著差异。高通量测序结果显示，不同类型土壤中细菌门水平群落组成大致相同，但PCoA结果显示，不同样本间细菌群落结构存在显著差异。Alpha多样性表明，真菌群落的丰富度与多样性差异明显大于细菌；且在4年参地土壤中微生物丰富度与多样性最低。相比于细菌，真菌群落对于环境因子的响应更加强烈，因此，从真菌群落控制角度改良土壤应是改良的主要方向。

4 讨论

土壤为植物的根系提供生长环境。植物生长所必需的水分、空气、矿质元素等需要植物从土壤中摄取。因此分析土壤的理化性质及生物学特性，可为创造植物更好的生长条件提供技术指导。已有研究表明，土壤pH影响着土壤酶活性和微生物群落组成空间的格局[12]，也与表层土壤微生物多样性和群落结构变化密切相关[13]。Shannon指数表明（表2），pH与细菌和真菌多样性均与呈现强烈正相关关系，相关性指数分别为0.7011和0.9715。栽参4年土壤中的pH显著低于其他类型，这与西洋参连作土壤中pH的变化一致[14]。已有研究表明，与铵态氮相比，硝态氮能够维持叶绿体结构的完整性，保持黄瓜植株正常的光合作用及生长，并减少碳水化合物向根系的运输，从而有效地抑制尖孢镰刀菌引起的黄瓜枯萎病的发生[15]。4年参地土壤中硝态氮含量远低于铵态氮含量，或与老参地中病害多发性相关。有效磷作为土壤中的一种速效养分，与土壤中真菌群落的多样性密切相关[16]，本研究发现土壤有效磷含量与真菌群落Shannon指数存在显著负相关关系(r=-0.8608)。目前已有研究表明，在玉米中接种被孢霉，可提高玉米根际土壤中有效磷的含量[17]。

同时，土壤微生物多样性对维持土壤生物群落功能 也 十 分 重 要[18]。 Proteobacteria、Acidobacteria、Actinobacteria、Chloroflexi、Bacteroidetes等是土壤中主要的细菌门类[19]。有研究表明，寡营养细菌Acidobacteria和Xanthomonadales在高胁迫环境，即相对贫瘠的土壤中的相对丰度较高[20]；而本研究发现，相较于人参连作土壤，Acidobacteria在林地中有较高的比例，这可能与Acidobacteriales在植物残体降解中的作用相关[21]。此外，辣椒-香蕉轮作系统刺激Acidobacteria中的成员Gp13和Gp12的相对丰度增加，且与病原菌F.oxysporum丰度呈显著负相关，推测其有很强的抑病潜力[22]。与其他两种类型土壤相比，4年参地中Xanthomonadales相对丰度较高，而Burkholderiales所占比例较低；这与太子参单作系统类似，其根系分泌物可以显著增加Xanthomonadales、Fusarium等，降低有益Pseudomonas和Burkholderiales的相对丰度，从而导致微生物群落失衡[23]。而人参根际微生物群落失衡和根系分泌物的积累导致的土传病害的爆发正是人参不连续栽培的关键因素[24]。目前已研究表明，枯草芽孢杆菌50-1[25]和淀粉样芽孢杆菌SW-34[26]的接种可显著降低人参病害的发生。同时，Burkholderia在芹菜与西瓜的栽培过程中也被证明有抑菌的功效[27]。

在世界范围内，土壤中的真菌主要分布在Ascomycota[28]。Ascomycota有寄生和腐生两种，腐生的子囊菌生长于土壤，朽木等；寄生的类群可能引起植物病害或与植物形成共生菌根，如Fusarium和Sclerotinia。Fusarium可引起黄瓜、草莓、番茄以及人参等多种植物发生病害[29-32]；其中Fusarium graminearum已经被证实与玉米穗霉病的发生相关[33]，在玉米根际土壤中也发现了Fusarium的大量富集，可能会导致潜在病害的发生。本研究在4年参地中还检测到了大量核盘菌属(Sclerotinia)微生物，这是我国东北人参产区严重流行的一种非典型坏死性病原菌。已有研究表明，人参核盘菌分泌液中的PG酶和Cx酶可导致参根出现坏死斑[34]，这可能是导致老参地不能继续栽参的原因之一。

在本研究中，我们在3种类型土壤中均检测到了大量的Mortierella，尤其在林地土壤中占有比例更高，Mortierella作为一种腐生产油真菌，具有多种农业效益，近年来引起了人们的广泛关注。在玉米土壤中接种Mortierella capitata后发现，其可通过改变根基因表达水平或与根际细菌间的相互作用促进作物的生长[17]。在对苹果再植土壤的研究中发现Mortierella可以通过竞争养分或其抗生素活性来抑制土传病原菌[35]。也有研究发现减轻土壤酸化会导致Mortierella丰度增加，并且其种类富集对作物产量有积极的影响[36]，与本研究中Mortierella和土壤pH间的正相关关系一致。同时，我们还发现Mortierella与土壤中有效磷的含量呈显著负相关，这与其他研究呈现相反的趋势[14,17,37]。此外，Mortierella还被证明具有降解多种除草剂[38]，缓解土壤重金属污染[39]，生物修复硫丹污染土壤[40]等多种生态功能。土壤真菌是土壤微生物重要的组成部分，其多样性和组成与土传病害相关，最近研究表明，调控土壤真菌群落是缓解番茄枯萎病的有力途径[41]。本研究的结果亦表明，有效调控农田土壤中的真菌群落组成是农田栽参土壤定向改良的关键环节之一。