花粉活力不同测定方法的比较和离体培养初探——黄山玉兰

胡迎峰，夏齐平

（安徽师范大学生命科学学院，安徽芜湖 241000)

0 引言

黄山玉兰(Yulania cylindrica)系木兰科木兰属落叶乔木，广泛分布于华东、华中等地[1]。花期为3—5月，且带有淡淡的芳香，因此广受欢迎，是优良的园林观赏树种，其花蕾可作药用，木材珍贵，已被列为三级濒危植物，花粉是该物种的重要种质形式之一[2]。目前，有关黄山玉兰的研究主要侧重于群落结构、种群特征[3]及形态结构[4]等，对繁殖系统相关研究仅见俞芹等[5]对花粉萌发特性的初步报道，且未对培养条件进行探索。

花粉活力是指花粉存活、生长、萌发、或者发育的能力，其活力直接影响到育种的成败，也是花粉质量的重要指标之一，准确的判定花粉活力是杂交育种工作顺利开展的基本条件之一[5-6]。常见花粉活力测定方法包括TTC染色法、MTT染色法、I2-KI染色法、FDA荧光染色法、醋酸洋红染色法、离体培养法等[7-9]。其中TTC和MTT染色法借助线粒体呼吸作用产物检测活性[10-11]；I2-KI染色法受淀粉含量影响较大，缺乏对细胞活性的检测能力[12]；FDA荧光染色法常用于跟踪测定花粉活力[13]；醋酸洋红染色法借助染色体染色，对死亡细胞不敏感[14]。各类染色法操作简便，但离体培养法在复杂操作的基础上，可以更真实的反应花粉活力[15-16]。因此，不同物种需要通过各类条件的摸索选择最合适的方法。陈景震等[17]用美国梾木(Cornus spp.)不同开花时期花粉活力探究活力下降原因。聂超仁[18]和陈玮婷等[19]对钟花樱桃(Cerasus campanulate)和6个非洲菊品种分别进行离体萌发实验，发现不同物种花粉所需的离体培养条件存在较大差异。为此，本研究选用MTT法[20]（3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐）、TTC法[21]（氯化三苯基四氮唑）、醋酸洋红染色法[22]分别测定黄山玉兰自然盛开、室内水培盛开、室内培养萎蔫时的花粉活力，并以适当浓度的蔗糖和硼酸对花粉进行离体培养[23-25]。期望为科学解决不同花粉活力测定方法应用效果的区别提供借鉴，并进一步减少花粉离体培养过程的盲目性。

1 材料与方法

1.1 花粉采集

实验采摘安徽师范大学赭山校区校园内正在盛开的黄山玉兰，要求采摘花药开裂的个体，且自然散粉。将花整体采摘后，做上标记小心放置，避免花粉损失过多。同时采摘部分盛开的，但花药并未开裂、未散粉的黄山玉兰，置于盛有蒸馏水的烧杯中水培，待花药开裂时，及时收集花粉。最后，待花萎蔫时再收集一次花粉。避免雨天采摘花朵，防止雨水对花粉活力造成影响，试验于2020年6月—2021年5月在安徽师范大学生命科学学院进行。

1.2 试剂配制

称取MTT 0.5 g，溶于100 mL的磷酸缓冲液(PBS)或无酚红的培养基中，配制0.5%的MTT溶液。用0.22 μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存。用pH 7.0的磷酸缓冲溶液和2,3,5-氯化三苯基四氮唑粉剂配制成0.5%的TTC溶液[25]。取45 mL冰醋酸，加蒸馏水55 mL，煮沸后徐徐加入洋红10 g，搅拌均匀后加入1颗铁锈钉，煮沸10 min，冷却后过滤，配制10%的醋酸洋红溶液，贮存在棕色瓶内备用。

1.3 不同方法花粉活力测定

1.3.1 MTT染色法 取20 μL的MTT溶液滴于载玻片上，用镊子或解剖针从花药上挑取适量的花粉放于载玻片上的MTT试剂中，混匀，并静置10 min，制成装片于光学显微镜下观察。随机选取3个视野进行计数，被染成紫色的即是有活性的，紫色越深，活性越大；反之，则无活性。

1.3.2 TTC染色法 取100 μL的TTC溶液滴加至2 mL的标号的PE管中，用镊子或者解剖针从花药上挑取适量的花粉放入PE管中的TTC试剂中，混匀，然后将PE管放置于37℃水浴锅中静置30 min。然后吸20 μL制作成装片于光学显微镜下观察。随机选取3个视野进行计数，其中被染成红色的即是有活性的，反之，没有活性[26-27]。

1.3.3 醋酸洋红染色法 取20 μL的醋酸洋红试剂于载玻片上，用镊子或者解剖针从花药上挑取适量的花粉于载玻片上的醋酸洋红试剂中，混匀，静置5 min，盖上盖玻片制成临时装片，并用吸水纸或者纸巾从一端吸取多余的醋酸洋红。若肉眼观察下载玻片颜色较深，可以在盖玻片边沿滴加适当的蒸馏水，并于另外一侧吸干。在光学显微镜下观察，随机选取3个视野进行计数，被染成红色的即是有活性的，反之，没着色的或者淡红色的，即无活性。

1.4 花粉离体培养

分别配制40%的蔗糖溶液，0.2%的硼酸溶液，并设置9个溶液体系[28（]如表1所示）。用镊子或解剖针从树上盛开且自然散粉的花药上面挑取适量的花粉放入溶液体系中，轻轻混匀，置于黑暗处静置36 h后，吸取50 μL制成装片并用1%的番红染色后，于光学显微镜下观察。

表1 9个不同浓度体系设计

2 结果与分析

2.1 活力测定结果

TTC染色法相比MTT染色法、醋酸洋红染色法更为复杂，需要水浴加热，且TTC染色法受限于花粉壁的薄厚情况[13]，以及花粉内的各种酶活性和花粉外壁的组成物质。所测得树上盛开自然散粉的花粉活力为54.82%，室内培养使散粉的花粉活力是51.11%，室内培养萎蔫的花花粉活力是12.63%（如图1），所测得的结果普遍偏低（如图1），且花粉着色稳定性差（如图2A）。

图1 3种方法测定3种状态黄山玉兰的花粉活力

醋酸洋红染色法几乎使得所有时期的花粉粒都着色（如图2C），测得在树上盛开自然散粉的花粉活力为98.23%，室内培养散粉的花粉活力是98.85%，室内培养萎蔫的花粉活力是93.75%，所测得的结果明显偏高。由于醋酸洋红的染色原理是醋酸洋红和花粉中的脱氢辅酶反应使得细胞着色，但是花粉失活时，部分酶的活性依然存在，因此导致结果偏高。

MTT染色法所测得在树上盛开自然散粉的花粉活力为94.47%，室内培养使散粉的花粉活力是84.68%，室内培养萎蔫的花粉活力是77.27%。花粉着色稳定性好，染色效果理想，并且有无活力的染色界限分明（如图2B）。

图2 花粉活力图示（A：TTC染色法；B：MTT染色法；C：醋酸洋红染色法）

2.2 花粉离体培养结果

第1、4、7号培养体系中的花粉萌发效果较好（如图3所示），花粉管较长。其中，1号培养体系中的花粉萌发效果最明显，花粉管最长，4、7号培养体系效果相似。其他培养体系下的花粉萌发效果不明显，仅可以看到花粉粒一端有短短的萌发管或完全看不见。

图3 不同体系下花粉萌发情况

对数据进行极差分析[29]（见表1），比较2个不同的因素对黄山玉兰花粉离体培养结果的影响，2种因素的极差值分别为16.05%、258.23%。由此可见，在花粉离体培养过程中，影响最大的是硼酸浓度。对由2种因素中的3个水平所对应的L1、L2、L3中3个不同的组合进行进一步分析，选择每个因素对应的花粉萌发率最大值的水平来表示适合花粉离体培养的最佳条件。其中，蔗糖浓度和硼酸浓度对应的活力最大值均为L1，即最佳的溶液浓度是5%的蔗糖溶液和0.01%的硼酸溶液，即1号培养体系，符合初步观察预期。

3 结论

依据上述实验，3种染色活力鉴定方法中，TTC染色法和醋酸洋红染色法都不适合黄山玉兰的花粉活性测定。3种状态的花粉活力测定结果为：树上自然散粉≥室内培养散粉≥萎蔫时，MTT染色法测得的结果呈线性降低（如图1），符合实际情况。综合分析，MTT染色法是最适合黄山玉兰活力测定的方法。且花粉离体培养最佳的溶液浓度是5%的蔗糖溶液和0.01%的硼酸溶液。

4 讨论

4.1 不同花粉活力测定方法的比较

在对通关藤和滇龙胆等花粉活力测定中，均选取活力最高对应的测定方法作为最适方法[20,23]。而本实验分别采用3种染色方法测定了3种不同情况下散粉的花粉活力。醋酸洋红所测得的室内培养的黄山玉兰散粉的花粉活力略高于树上自然散粉的花粉活力，但是同样的花粉在TTC染色法和MTT染色法测定下，都得出树上自然散粉的花粉活力高于室内培养散粉的花粉活力。这表明，醋酸洋红所测得的数值比真实情况高，且存在显著性差异。且实验采摘的黄山玉兰都是盛开时期，所以树上自然散粉的花粉活力应该是最强的时期，且离体培养结果为92.35%，但用TTC染色法测定的活力只有54.82%，因此TTC染色法测得的花粉活力偏低，同时TTC染色结果颜色稳定性差，低活性的和无活性的染色界限不明显，不适用于黄山玉兰花粉活力的检测。未来可根据不同检测方法对不同物质的灵敏度来设计进一步实验，以证明不同检测方法对不同物种的差异性根本原因。

4.2 花粉离体培养条件的探讨

花粉的萌发是准确确定花粉活力的标尺，花粉离体萌发的最适合浓度为利用花粉萌发来测定花粉活力提供了有效的基础理论依据[18]。蔗糖在花粉的萌发和花粉管的生成中提供了能量和碳源，同时还有利于花粉内外的渗透压保持平衡[30-31]，所以适度的蔗糖能促进花粉管的萌发。硼酸则促进花粉对糖类的代谢、吸收等，促进花粉管内果胶物的合成[31]。自然情况下，花柱内以及柱头可以提供花粉萌发所需要的硼酸。从本研究结果看，在所设计的3个浓度梯度的体系中，硼酸的浓度变化对花粉管的萌发起了很大的影响。过高的硼酸和蔗糖浓度明显的抑制了花粉管的萌发和伸长。因此，需要为不同物种探讨出所对应的最佳离体培养条件，为后续育种相关工作奠定基础。