德宏州辣椒病毒病发生情况调查及其毒源种类

银馨 岳元保 丁家盛 王根权 张培花 李翱 李学梅 段雪甜

摘要：对德宏州州内辣椒种植地区病毒病的发生情况进行了调查，发现在全州各县市辣椒种植地均有病毒病的发生，发病症状主要以花叶、皱缩、落叶、落果、叶脉褐变、顶枯、畸形为主，单独或混合发生，发病率在5%～30%，严重的达50%以上。对采自德宏州5个县市的111份辣椒样品进行了DAS-ELISA、Dot-ELISA检测以及PCR检测。检测结果表明，在检测的111份样品中，有55份辣椒样品感染了所检测病毒，病毒检出率为49.55%，病毒种类有13种，其中以番茄斑萎病毒属（Tospovirus）的番茄环纹斑点病毒（Tomato zonate spotted virus，TZSV）占29.10%，其次是番茄花叶病毒（Tomato masaic virus）占23.64%，烟草曲茎病毒（Tobacco curly shoot virus，TbCSV）占9.09%，泰国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl Thailand virus，TYLCV）、烟草曲茎病毒DNA1卫星、中国胜红蓟黄脉病毒和PaMMV（辣椒轻型斑驳病毒）各占5.45%。

关键词：辣椒病毒病;发病情况;ELISA检测;PCR检测

辣椒是茄科辣椒属的一年生草本植物，是世界上一种重要的蔬菜作物和调味品[1]。辣椒富含粗蛋白、粗脂肪、辣椒素、辣椒碱、维生素、钙和磷等物质，其中辣椒中维生素C含量居各种蔬菜作物之首。此外，辣椒的果实、根、茎枝均可入药。辣椒素有“红色药材”之称，能温中散寒，健胃消食;外用能治冻疮，风湿痛，腰肌痛[2-3]。

辣椒病毒病是辣椒生产过程中的灾难性病害之一，常导致辣椒落叶、落花、落果，可减产30%～70%，甚至绝收。目前在全球范围内，已发现40种以上的病毒能侵染辣椒。而且，辣椒病毒病的发生和危害呈逐年加重的趋势[4-6]。为了明确云南省德宏州当前辣椒病毒病的毒株种类，以期全面掌握德宏州内的辣椒病毒病病源种类以及危害程度。于2015年底～2017年初，在德宏州的芒市、瑞丽市、陇川县、盈江县、梁河县5个县市辣椒种植田块进行辣椒病毒病发病情况的调查。并在实验室内，利用DAS-ELISA和Dot-ELISA技术对德宏州5个县市的采集的辣椒病毒病样品进行了常见病毒的血清学检测，同时利用PCR技术对20种辣椒病毒病进行了检测。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2015年12月～2017年2月，在德宏州的芒市、瑞丽市、陇川县、盈江县、梁河县5个县市辣椒种植田块调查辣椒病毒病发病情况，采集典型病毒病症状的辣椒叶片、嫩梢和果实样品，并对所采集的辣椒样品进行统一编号和症状记载。将所采集的辣椒样品分别装入标记自封袋中，放入-20℃的冰箱中冷冻保存备用。

1.2 病毒病原检测

1.2.1 番茄斑萎病毒属病毒检测

采集感病的辣椒典型番茄斑萎病毒病害样品分别用tospoviruses抗血清进行DAS-ELISA和dot-ELISA检测，用于DAS-ELISA检测的抗血清有INSV、IYSV和GRSV/TCSV复合抗血清购自美国Agdia公司。用于dot-ELISA的TZSV、GYSV、WSMoV、HCRV多克隆抗体由本实验室制备，按1/3000进行稀释，TSWV单克隆抗体由浙江大学周雪平教授提供，按1/3000进行稀释。

1.2.2 菜豆金色花叶病毒属病毒检测

采用CTAB法提取典型双生病毒病害症状病株叶片总DNA。利用菜豆金色花叶病毒属病毒简并引物PA/PB进行PCR检测，该引物扩增的目的条带为该属病毒基因共同區及外壳蛋白保守区约500 bp的基因片段。与此同时，利用beta卫星通用引物β01/β02和alpha卫星通用引物UNA101/UNA102对双生病毒典型病株进行PCR检测，这两对引物的目的条带分别为其卫星全长。PCR反应体系：10×PCR反应缓冲液（含Mg2+）2.5 μL、2.5 μmol/L dNTPs 2 μL、20 μmol/L上、下游引物各0.5 μL、Taq Plus DNA聚合酶（5 U/μL，上海申能博彩生物科技有限公司）0.5 μL、植物总DNA 125 ng，加双蒸水定容至25 μL。扩增条件：94℃预变性2 min;94℃变性45 s，50℃退火45 s，72℃延伸50/90 s，30个循环;72℃延伸10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测。紫外灯下割取目的片段，利用Axygen DNA凝胶回收试剂盒分离纯化，回收产物连接到pGEM-T Easy（Promega，Madison，WI）载体上，通过热击法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中，挑选阳性克隆，委托上海立菲生物技术有限公司进行测序。

2 结果与分析

2.1 辣椒病毒病的发生情况

根据2015～2017年田间调查结果，德宏州辣椒病毒病在德宏州芒市风平镇、瑞丽市勐卯镇、陇川县景罕镇、盈江县旧城镇等辣椒主产区均有发生，常见的发病类型有4种：（1）花叶型：病症是叶、果出现不规则退绿、斑驳，严重时植株矮化，叶、果皱缩，果实难以转红或局部转红，僵化。（2）黄化型：病叶变黄，严重时形成上黄下绿，植株矮化并伴有明显落叶。（3）坏死型：表现为叶片上呈现不规则的红褐色和深褐色病斑、叶脉褐变坏死甚至顶枯。（4）畸形型：表现为叶片增厚、变小或呈蕨叶状，植株节间缩短、矮化呈丛簇状，病果畸形、凹凸不平，容易落果。主要以花叶和矮缩畸形混合发生比较普遍，坏死发生不成片，一般零星发生。

2.2 辣椒样品的病毒种类分析

2015年12月～2017年2月在德宏州芒市、瑞丽市、陇川县、盈江县、梁河县5个县市共采集了111份辣椒样品。实验室病毒病检测结果显示，有55份辣椒样品检出病毒，病毒检出率为49.55%。实验方法检测的病毒种类共有20种，实验检出病毒种类13种，其中以番茄斑萎病毒属的番茄环纹斑点病毒（TZSV）为主，占29.09%，其次是番茄花叶病毒，占23.64%，烟草曲茎病毒占9.09%，泰国番茄黄化曲叶病毒、烟草曲茎病毒DNA1卫星、中国胜红蓟黄脉病毒和PaMMV（辣椒轻型斑驳病毒）各占5.45%，烟草曲叶病毒、WSMoV（西瓜银色斑驳病毒）和番茄黄化曲叶病毒各占3.64%，朱顶红褪绿环斑病毒、中国番茄黄化曲叶病毒和棉花曲叶病毒Beta卫星各占1.82%（见图1）。

瑞丽共检测到7种病毒（表1，下同）。其中，番茄花叶病毒和TZSV（番茄环纹斑点病毒）检出数均为11个样品，占瑞丽市检出总样品的比率均为36.67%，是瑞丽辣椒上的优势毒源;其次烟草曲茎病毒、烟草曲茎病毒DNA1卫星和中国胜红蓟黄脉病毒检出数占瑞丽检出总样品的比率均为6.67%;朱顶红褪绿环斑病毒和PaMMV（辣椒轻型斑驳病毒）检出数占瑞丽检出总样品的比率均为3.33%。陇川共检测到9种病毒。主要以TZSV（番茄环纹斑点病毒）为主，检出数占陇川检出总样品的比率达21.43%;其次WSMoV（西瓜银色斑驳病毒）、番茄花叶病毒和番茄黄化曲叶病毒检出数占陇川检出总样品的比率均为14.29%;泰国番茄黄化曲叶病毒、烟草曲茎病毒、棉花曲葉病毒Beta卫星、烟草曲茎病毒DNA1卫星和中国胜红蓟黄脉病毒检出数占陇川检出总样品的比率均为7.14%。盈江共检测出4种病毒。主要以泰国番茄黄化曲叶病毒和烟草曲叶病毒为主，检出数占盈江检出总样品的比率均为33.33%;其次是中国番茄黄化曲叶病毒和TZSV（番茄环纹斑点病毒），检出数占盈江检出总样品的比率均为16.67%。芒市共检测出3种病毒，以烟草曲茎病毒为主，检出数占芒市检出总样品的比率为50.00%，其次是TZSV（番茄环纹斑点病毒）WSMoV（西瓜银色斑驳病毒），检出数占芒市检出总样品的比率均为25.00%。梁河检测到1种病毒为PaMMV（辣椒轻型斑驳病毒），检出数占梁河检出总样品的比率为100.00%。

3 结论与讨论

对德宏州州内辣椒种植地区进行了病毒病发生情况的调查，发现在全州各县市辣椒种植地均有病毒病的发生，发病症状主要以花叶、皱缩、落叶、落果、叶脉褐变、顶枯、畸形为主，单独或混合发生，发病率在5%～30%，严重的达50%以上。芒市风平镇、盈江县旧城镇露地番茄黄化曲叶症状比较明显，以点片发生为主。瑞丽市勐卯镇、陇川县景罕镇大多数为大棚栽培，栽培管理比较好，辣椒病毒病发病较轻，发病率大部分在5%以下。这表明栽培管理措施是控制病毒病发生的关键因素。

本次共采集了111份辣椒样品进行病毒病检测，其中有55份辣椒样品带毒，病毒检出率为49.55%，病毒种类有13种，结果表明德宏州的辣椒病毒种类较多，并且各县市的病毒种类和优势毒源存在较大差异，TZSV（番茄环纹斑点病毒）是，芒市、瑞丽市、陇川县、盈江县辣椒上的优势毒源，PaMMV（辣椒轻型斑驳病毒）是梁河县辣椒上的优势毒源。

已有研究表明，辣椒上的病毒种类很多[5]，由于本试验采集样品数量和检测的病毒种类有限，因此引起本地区辣椒病毒病的毒源可能还有其他种类，这还需进一步的检测鉴定。

参考文献

[1] 刘易伟，胡文忠，姜爱丽，等.辣椒的营养价值及其加工品的研发进展[J].食品工业科技，2014，35（15）：377-381.

[2] 温变英.辣椒的营养药用价值及其开发利用[J].特种经济动植物，2007（8）：38-39.

[3] 刘春艳.辣椒的食用价值[J].辣椒杂志，2006（4）：39.

[4] 汪沛，汤琳菲，雷艳，等.辣椒病毒病研究进展[J].湖南农业科学，2015（7）：151-154.

[5] 林燕春.辣椒病毒病发生规律与防治技术研究[J].湖北农业科学，2009（9）：2142-2144.

[6] 刘峰.辣椒病毒病发生规律与防治技术研究[J].江西农业学报，2009，21（6）：100-102.