经典瞬时受体电位通道1在重度子痫前期孕妇脐动脉平滑肌中的表达及意义*

袁德丽，周 清，傅晓冬

1.西南医科大学附属医院 产科(泸州 646000)；2.西南医科大学附属医院 中心实验室 (泸州 646000)

妊娠期高血压疾病是一类独有的妊娠并发症，该疾病以高血压、蛋白尿、抽搐等为临床特点，严重时可发生脑卒中、多个器官功能衰竭，是直接导致母婴死亡的第二原因，严重威胁母婴安全。重度子痫前期(severe preeclampsia，SPE)是妊娠期高血压疾病中危害程度较高且好发的一种类型，可累及各脏器功能及全身血管。慢性高血压是孕期发生子痫前期的独立危险因素。妊娠期高血压疾病孕妇后期罹患高血压的风险较正常孕妇明显升高，且子痫前期的严重程度与未来心血管风险程度相关[1]。经典瞬时受体电位通道1(transient receptor potential canonical 1，TRPC1)是位于生物膜上的非选择性阳离子通道。研究[2-3]报道，TRPC1参与储存的钙库操作钙进入(store operated calcium entry，SOCE)途径。该途径是内质网/肌浆网重拾钙的主要机制，稳定内质网/肌浆网钙储存，参与细胞收缩、增殖、迁移、凋亡等调控，在血管舒缩、运动及重构中发挥重要作用。关于TRPC1在SPE人脐动脉平滑肌中表达的相关研究还鲜见报道，本研究旨在分子水平方面比较分析SPE、慢性高血压并发SPE(chronic hypertension complicated with severe preeclampsia，CHPE)及正常孕妇的脐动脉平滑肌中TRPC1的表达情况，探究TRPC1与SPE之间的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2020年1—8月在西南医科大学附属医院产科确诊为SPE和CHPE的单胎孕妇各15例为研究对象，分别设为SPE组和CHPE组，另选取同期正常健康单胎孕妇15例为对照组。诊断标准：SPE及CHPE符合《妇产科学》[4]诊断标准。纳入标准：正常孕妇为无妊娠并发症及合并症的健康孕妇；2)育龄期妇女；3)孕周≥28周；4)单胎妊娠者。排除标准：1)除慢性高血压外，既往患心脏病及肺动脉高压等心血管疾病；2)严重妊娠期并发症及内外科合并症；3)吸烟饮酒史及传染病史。本研究经西南医科大学附属医院伦理委员会审核并通过，所有孕妇及家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 材料与方法

1.2.1 主要试剂耗材及仪器 总RNA提取试剂盒(北京,Tiangen公司)，反转录试剂盒及荧光定量PCR(qPCR)试剂盒(日本,Toyobo公司)，内参gapdh及目的trpc1基因上下游引物(上海,Sangon Biotech公司)，TRPC1、GAPDH一抗及山羊抗兔二抗(武汉，三鹰公司)，核酸浓度检测仪(美国,Hermo Scientific公司)，qPCR系统(新加坡,Applied Biosystems公司)，电泳及转膜装置系统(美国,Bio-Rad公司)，发光成像仪(法国,Fusion Solo公司)。

1.2.2 标本取材 按上述标准选取研究对象，终止妊娠胎盘娩出后，立即从新鲜无菌脐动脉的两端及中间部位各选取一段组织，每段长约3 cm，置于低温标本箱中转运至无菌操作台，断端辨认脐动脉后，在冰浴上顿性撕剥脐动脉周围的胶质及系膜组织，快速分离脐动脉血管，预冷无菌水漂洗后放入1.5 mL无菌EP管中，在液氮中迅速降温冻凝，转置-80 ℃冰箱长期超低温冻存。整个过程无菌操作，迅速完成，减少组织中RNA及蛋白质降解。将冻存的脐动脉平滑肌组织在液氮超低温环境中碾磨成粉并分装，一部分用于qPCR检测，一部分用于蛋白质印迹技术检测。

1.2.3 qPCR技术检测trppc1 mRNA表达 根据试剂盒说明书操作加入裂解液(100 g/L)裂解细胞，逐步净化提取RNA，凝胶电泳成像检测RNA浓度完整度，核酸浓度检测仪测定mRNA浓度，选取RNA完整度高、浓度适中的样品按10 μL体系逆转录成cDNA，置于-20 ℃冰箱低温冻存。选取gapdh管家基因作为内参基因，以20 μL体系行qPCR检测。通过使用△Ct值来表示trpc1基因与gapdh基因相对表达差异。qPCR结果中Ct值表示qPCR循环扩增倍数，△Ct值为目的基因trpc1与内参基因gapdh的Ct差值，△Ct越小，则代表原始样本中基因表达量越高。

1.2.4 蛋白质印迹技术检测TRPC1 蛋白表达将上述已碾磨成粉的组织加入含有蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液(100 g/L)中，超声破碎仪将组织细胞多次超声后使细胞震裂致碎，组织蛋白被释放至细胞外，离心(4 ℃，12 000 r/min，离心半径8 cm)，取上清液，按4∶1比例添加蛋白上样缓冲液混匀，置于65 ℃水浴中使蛋白变性，迅速放进-20 ℃冰箱低温保存备用。配置5%的浓缩胶和8%的分离胶，行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后切胶、转膜、5%脱脂牛奶封闭，4 ℃低温摇床中过夜孵育一抗TRPC1(1∶1 000)及GAPDH(1∶3 000)，PBST洗膜30 min后常温摇床中孵育二抗(1∶3 000)1 h，再次洗膜30 min，置于成像仪中曝光，使用Fusion Solo软件测定TRPC1及GAPDH条带灰度值。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 3组一般资料比较

3组年龄及孕周比较，差异无统计学意义(P>0.05)。SPE组、CHPE组的孕期收缩压、舒张压分别与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。SPE组与CHPE组的收缩压比较，差异有统计学意义(P<0.05);两组舒张压比较,差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1 3组一般资料比较

2.2 3组trpc1 mRNA的表达水平比较

qPCR结果显示，SPE组及CHPE组脐动脉血管平滑肌细胞trpc1 mRNA表达水平均高于对照组(P<0.05);SPE组与CHPE组比较,差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。

表2 3组trpc1 mRNA的表达水平比较

2.3 3组TRPC1蛋白表达水平比较

蛋白质印迹技术结果显示,SPE组、CHPE组脐动脉血管平滑肌细胞TRPC1蛋白表达水平均高于对照组(P<0.05);SPE组与CHPE组比较，差异无统计学意义(P>0.05)(图1、表3)。

图1 3组脐动脉血管平滑肌中TRPC1蛋白表达

表3 3组TRPC1蛋白表达水平比较

3 讨论

妊娠期高血压疾病是以高血压和蛋白尿为特征的妊娠全身性血管疾病，其中SPE发病率高且危害性大。SPE具体的发病机制至今尚未明确。胎盘因素引起的胎盘螺旋动脉重塑不足和母体广泛的氧化应激免疫反应组成的两阶段理论被认为与SPE病理生理学有关[5]，近年也有学者[6]提出三阶段学说。研究[7]报道，缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)可诱导可溶性血管内皮生长因子受体1引起的全身血管内皮功能障碍，也可与特殊受体相结合,释放相应的细胞内信号转导因子，从而作用于TRPC1通道，参与血管平滑肌细胞收缩及细胞增殖并诱发血管重塑[8];HIF-1α在SPE孕妇胎盘中表达明显增高[9]。因此，TRPC1可能与SPE的病理学改变有关。

既往SPE孕妇胎盘或脐动脉平滑肌细胞离子通道的研究中，Kv7[10]、BK-Ca[11]、TRPC6[12]、氯离子[13]等通道均被证实与SPE发病相关。瞬时受体电位通道(transient receptor potential channel，TRP)是一类非选择性、非电压门控性阳离子通道蛋白，主要介导Na+、Ca2+等阳离子内流。TRP家族共包括7个亚家族(TRPA、TRPC、TRPM、TRPN、TRPP、TRPV、TRPML)，TRPC1通道是TRPC家族成员之一[14]，在心肌、骨骼肌、血管等多种平滑肌细胞中广泛表达[15]。研究[16]发现，在敲除小鼠L型钙通道后的主动脉环和分离的血管平滑肌细胞实验中，5-羟色胺或毒胡萝卜素可通过SOCE途径增强细胞内游离Ca2+浓度并刺激主动脉收缩，表明SOCE途径参与钙内流及血管收缩。Kunichika等[17]通过腺病毒转染、离体大鼠肺动脉血管环实验发现，过表达TRPC1通道组中，由环吡嗪酸诱导的Ca2+进入引起的主动张力明显增强,表明TRPC1过表达可增强血管张力。Chen等[18]通过小血管肌电图观察发现，与正常小鼠相比，去甲肾上腺素诱导的自发性高血压小鼠肠系膜小动脉血管运动明显增加，TRPC1表达上调；用抗TRPC1抗体预孵育肠系膜小动脉，可明显降低去甲肾上腺素诱导的血管运动和钙内流。该结果表明，TRPC1与血管生成、舒缩功能及血压调节之间有不同程度的联系。

本研究结果显示，SPE及CHPE孕妇脐动脉血管平滑肌细胞中TRPC1mRNA及其蛋白水平表达均高于对照组,此结果与原发性高血压与肺动脉高压动物模型试验[18]中结果趋于一致。SPE患者胎盘血氧灌输相对缺乏，胎盘微血管长期处于低氧状态，低氧可通过RhoA/Rho激酶途径诱导HIF-1α增加，使TRPC家族通道表达上调[19]。促血管收缩剂通过激活经典的G蛋白-PLC-PKC信号通路，使细胞膜上G蛋白偶联受体及活化的磷脂酶C将磷脂酰肌醇4，5-二磷酸分解为肌醇-1,4,5三磷酸(inositol triphosphate，IP3)和二酰甘油，IP3可作用于内质网/肌浆网膜上的IP3受体开放SOCE途径[20]。TRPC1主要参与SOCE途径，储存Ca2+消耗后,激活Ca2+传感器基质相互作用分子1可直接[21]或间接通过钙释放激活钙通道调节分子[22]作用于TRPC1通道，介导细胞外Na+、Ca2+进入细胞质内，诱导细胞膜去极化，促进Ca2+内流，诱发血管收缩。本研究发现，SPE组与CHPE组脐动脉血管平滑肌TRPC1蛋白表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)，可能是因为慢性高血压疾病起病早，病情持续周期长，机体相对缺氧环境及血管高压已产生耐受，因此慢性高血压并发SPE后，TRPC1上调水平不明显，并且TRPC1在SPE及CHPE疾病的发病机制尚不明确。因此，TRPC1通过对Ca2+的调控参与血管舒缩调节，TRPC1的过表达可能与SPE疾病发生发展有关。

综上所述，SPE与CHPE孕妇脐动脉平滑肌中TRPC1较正常孕妇表达高，提示SPE的发病机制或与脐动脉平滑肌中TRPC1的过表达相关。关于TRPC1在妊娠期高血压疾病各类型中具体扮演何种角色，可采取动物建模、细胞培养、离体血管环等实验进一步论证，以期在探究SPE的发病机制及治疗中开辟新思路。