非酒精性脂肪肝对免疫检查点抑制剂治疗肝细胞癌疗效的影响及机制研究进展

袁野，彭慧，田德安

0 引言

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是全球癌症死亡第三大常见原因[1]。对HCC的治疗方法，如肝移植、肿瘤切除术或消融术仅限于早期肿瘤；多激酶抑制剂、化疗等被批准用于晚期HCC。免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors,ICIs），如抗程序性死亡受体-1/配体-1（programmed cell death protein-1/ligand-1,PD-1/PD-L1）被认为可以激活对癌症的免疫监测。近年来，越来越多的指南、共识推荐免疫联合方案作为晚期肝细胞癌一线治疗的优选方案[2-3]。随着饮食结构的变化，相较于病毒性肝炎，非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）已经成为我国常见的慢性肝病[4]。10%～20%的NAFLD患者会进展到非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis,NASH），约38%的NASH患者会发展为肝细胞癌[5]。

NAFLD有多种状态，当疾病演变为NASH状态时临床表现非常明显，在炎性反应初期可能会有肝脏损伤、炎性反应发生和纤维化的叠加表现[6]。肝脏细胞脂肪样变的主要原因是体内甘油三酯的储存增加，同时，体内循环的自由脂肪酸水平升高和脂肪的从头合成增加也会加速肝脏细胞的脂肪样变[7]，而肝脏内甘油三酯和胆固醇的聚集也给NASH的发生创造了更加有利的环境。

在NAFLD-NASH的形成以及NASH转化为肝细胞癌的过程中，免疫微环境的改变至关重要。目前，NASH已经成为HCC的一个重要危险因素，且非酒精性脂肪肝相关HCC比病毒性肝炎相关HCC的生存期更短，免疫检查点抑制剂治疗疗效更差[8]。因此，非酒精性脂肪肝对肝脏免疫微环境、HCC免疫检查点抑制剂疗效的影响和机制，以及如何改善非酒精性脂肪肝相关HCC患者免疫治疗的疗效值得研究。

1 非酒精性脂肪肝对肝脏免疫微环境的影响

脂质的聚集是非酒精性脂肪肝中常见的代谢改变，这种改变可能与免疫功能的失活相关。

1.1 非酒精性脂肪肝引起CD4+T淋巴细胞的消耗

在NAFLD的小鼠模型中，亚油酸积累引起脂质代谢失调导致CD4+T淋巴细胞死亡，从而改变肝脏内免疫系统平衡，促进肝损伤。此外，研究分析NASH、酒精性和病毒性肝病患者活检标本中CD4+T淋巴细胞的浓度，发现NASH患者中CD4+T淋巴细胞计数较少，证实肝脂肪引起CD4+T淋巴细胞的消耗，且CD4+T淋巴细胞的死亡主要是由氧化应激引起的[9]。

在122例非酒精性脂肪肝患者的血浆中，质谱检测NASH患者自由基介导的亚油酸氧化产物较NAFLD患者显著升高。此外，氧化产物量与肝脏组织学特征（主要是炎性反应和纤维化）的严重程度呈正相关[10]。

1.2 非酒精性脂肪肝引起CD8+T细胞功能失活

在脂质聚集的微环境中，当抗原被过度呈递后可能会导致T细胞耗竭，且超长链脂肪酸的聚集会导致CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的功能失活。CD8+T细胞可以分化成IL-9分泌细胞（Tc9），Tc9细胞发挥更强的抗肿瘤反应。细胞中的胆固醇含量显著影响IL-9的表达和Tc9的分化，胆固醇是Tc9细胞分化和功能的关键调控因子[11]。CD8+T细胞通过IL-15驱动的代谢激活来执行自动攻击，可能与慢性肝损伤导致NASH患者向肝癌发展相关[12]。

1.3 非酒精性脂肪肝引起代谢重排影响T细胞的抗肿瘤活性

在HCC微环境中，Treg细胞的增多与它们利用脂类和葡萄糖的能力有关。在肿瘤微环境中，促炎免疫细胞的有氧糖酵解速率增加[13]。

1.4 非酒精性脂肪肝引起Kupffer细胞活化

Kupffer细胞约占肝脏非实质细胞的20%。高脂饮食的刺激使Kupffer细胞数量增多，激活NK-T细胞，诱导细胞坏死与凋亡。同时在非酒精性脂肪肝环境下，Kupffer细胞分泌的肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）和促炎因子，如白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）的水平显著升高，促进炎性反应。此外氧化应激可以促进Kupffer细胞活化，分泌更多的趋化因子及细胞因子，促进NAFLD的发展[14]。

2 非酒精性脂肪肝对HCC免疫检查点抑制剂疗效的影响

2.1 临床研究

IMbrave 150全球多中心Ⅲ期临床研究确定了阿替利珠单抗联合抗血管内皮生长因子α抗体贝伐珠单抗作为新的晚期HCC一线治疗标准。阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗与索拉非尼相比，中位总生存时间（overall survival,OS）改善了5.8个月，无进展生存时间（progression free survival,PFS）改善了2.6个月，两组患者的不良事件发生率相当[15]。然而，该研究中69.5%的患者为病毒性肝炎相关HCC。最近一项更新的IMbrave 150试验亚组分析报道，与非索拉非尼相比，阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗对非病毒性肝炎相关HCC患者没有产生OS获益（中位OS：17.0月vs.18.1月）[16]。

KEYNOTE-240Ⅲ期研究队列包含了大多数（60.0%）非病毒性肝炎相关HCC患者，研究显示，在既往接受索拉非尼治疗的患者中，帕博利珠单抗的OS和PFS没有改善[17]。CheckMate-459Ⅲ期试验未能显示相较于索拉非尼，纳武利尤单抗作为一线治疗的OS或PFS延长[18]，而非病毒性肝炎相关HCC患者从纳武利尤单抗中获益较少[19]。

Pfister对三项晚期HCC患者免疫治疗的大型随机对照Ⅲ期临床试验（CheckMate-459、IMbrave 150和KEYNOTE-240）进行亚组荟萃分析发现：与索拉非尼对照组相比，免疫检查点抑制剂提高了总体患者的生存率，但非病毒性肝炎相关HCC患者的生存率无差异。为了探讨肝脏基础疾病对PD-1/PD-L1免疫治疗的影响，该研究分析了一项包含130例PD-1免疫治疗肝细胞癌患者的队列研究，其中有13例患者合并NAFLD，结果表明同时患有NAFLD的HCC患者预后更差，中位生存期为5.4个月，而无NAFLD患者的中位生存期为11个月。该研究进一步分析了另一项包含118例接受PD-1/PD-L1免疫治疗肝细胞癌患者的队列研究，其中有11例患者合并NAFLD，结果表明同时患有NAFLD的HCC患者中位生存时间较其他患者更短，为8.8个月，而其他组别患者的中位生存时间为17.7个月。尽管非酒精性脂肪肝合并HCC患者的样本量较小，我们依旧可以观察到NAFLD合并HCC的患者在接受抗PD-1治疗后预后更差[20]。最近，一项对包括3 739例患者的8项随机对照试验的荟萃分析证实，ICIs治疗非病毒性肝炎相关HCC患者的效果更差[21]。

2.2 动物研究

在NASH诱导的HCC小鼠模型中，针对PD-1的免疫治疗增加了肿瘤内CD8+PD1+T细胞数量，但没有导致肿瘤缩小或消退，而三种采用CRISPRCas9技术构建的转基因型非NASH肝癌小鼠模型对PD-1免疫治疗产生反应，生存时间延长，表明NASH背景下肿瘤免疫监视受损。NASH小鼠接受抗PD-1治疗后肝损伤没有变化，且肝脏中含有更多的CD8+T细胞，提示CD8+T细胞帮助诱导非酒精性脂肪肝相关HCC，而不是激活或执行免疫监视，研究发现通过抗CD8和抗PD-1联合治疗可以改善NASH，同时将CD8+PD1+T细胞剥离后，肝脏的损伤和肝癌的发生率明显减少[20]。

综上所述，这些研究提示非酒精性脂肪肝相关HCC的免疫治疗疗效降低。

3 非酒精性脂肪肝影响HCC免疫检查点抑制剂疗效的机制

3.1 非酒精性脂肪肝CD8+PD-1+T细胞增多导致肝脏细胞增殖能力缺陷

一项研究通过质谱和流式细胞术对非酒精性脂肪肝相关HCC患者和其他类型HCC患者进行检测，结果显示CD8+PD-1+T细胞（CD8+PD-1+CD103+）的数量显著增高。PD-1+细胞在健康者肝脏组织中未见，而在NASH/NAFLD患者的肝脏组织中存在。研究人员使用单细胞RNA测序后发现，与对照组相比，NASH/NAFLD患者组织表达一些独特的基因标志物：IL7R、SELL、TCF、CCL5、CCL3、PDCD1、CXCR6、RGS1和KLF2，这也和NASH小鼠的表达特征相匹配。肿瘤不仅在接受抗PD-1免疫治疗后没有反应，还加速了纤维化和演变成更加恶性的结果。更加值得注意的是，研究显示驻留的CD8+T细胞造成肝脏细胞增殖能力的缺陷，这可能是CD8+PD-1+T细胞导致免疫监控不足，且非酒精性脂肪肝相关HCC患者接受抗PD-1免疫治疗后出现肝脏组织损伤的原因[20]。

3.2 非酒精性脂肪肝锌指蛋白64激活CSF1抑制抗肿瘤免疫

肝脏组织中有大量的巨噬细胞并且在肿瘤发生过程中发挥了重要作用，免疫逃避可以导致免疫检查点阻断剂治疗的抵抗作用[22-25]。锌指蛋白64（ZFP64）是一个Kruppel型C2H2转录因子，在结肠癌肝转移肿瘤组织中表达上调[26]。研究指出ZFP64可以加速肿瘤的形成，但是具体机制还有待研究[27]。对接受过抗PD-1免疫治疗的HCC患者肝脏组织进行高通量测序，显示ZFP64基因表达上调[28]，而且肝细胞癌患者中的ZFP64可增加CSF1（colony-stimulating factor 1）的转录并且促进巨噬细胞M2型极化和聚集。这说明ZFP64可以通过激活CSF1的转录促进肿瘤的发生发展，还可以诱导生成免疫抑制性的肿瘤微环境。PKCa（protein kinase C）是一种在肝细胞癌肝脏组织中高度表达的激酶并且可以磷酸化ZFP64第226位丝氨酸，并促进ZFP64的核定位和泛素化，这也提示PKCa、ZFP64和CSF1形成了一个可以促进免疫逃逸的信号轴[27]。

3.3 非酒精性脂肪肝PCSK9下调LDLR水平抑制肿瘤微环境中CD8+T细胞免疫应答

PCSK9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9）是调节胆固醇代谢的关键蛋白，由肝脏产生并且可与肝脏细胞表面低密度脂蛋白受体（LDLR）结合，使其降解[29-31]。研究发现肿瘤细胞敲除PCSK9后可以显著抑制肿瘤的生长，并且增强抗PD-1治疗的疗效。实验人员将小鼠乳腺癌细胞（4T1）、黑色素瘤细胞（B16、F10）及结肠癌细胞（CT26、MC38）敲除PCSK9后，发现小鼠的生存明显延长且对抗PD-1治疗的效果更好[32]。有研究使用流式细胞技术分析PCSK9敲低肿瘤组织，发现肿瘤浸润增加，同时体外杀伤实验表明，PCSK9过度表达显著抑制CD8+T细胞抗肿瘤活性[33]。而PCSK9通过与主要组织相容性复合体-Ⅰ（major histocompatibility complex-Ⅰ,MHC-Ⅰ）结合，使其迁移和降解的过程受到干扰，影响抗原呈递，从而影响抗肿瘤免疫[32]。LDLR是一种LDL的转运体，而LDLR的不足会导致反馈性高LDL[34]。PCSK9是一种LDLR的负性调节因子，可与LDLR表面结合并使其降解，已被确定为治疗高胆固醇血症的靶点[35-37]。LDLR介导的胆固醇摄取在肿瘤微环境CD8+T细胞中显著降低。而PCSK9在肿瘤中高表达，可以下调LDLR水平，阻碍TCR信号转导和效应功能并抑制肿瘤微环境中CD8+T细胞的免疫应答[33]。抑制PCSK9的表达可以有效减少MHC-Ⅰ分子在溶酶体中的降解，显著提高肿瘤细胞表面MHC-Ⅰ的表达和抗原递呈，从而增强机体抗肿瘤免疫应答。同时抑制PCSK9的表达，可以增加肿瘤微环境中多种细胞毒性T细胞的浸润比例。

3.4 非酒精性脂肪肝中免疫应答缺失导致肝细胞损伤

既往研究已经揭示氧化水平能够调节NASH患者对抗原表位的识别能力，并且这种氧化水平能导致肝脏的自我损伤[35]。这些在抗PD-1免疫治疗后增加的CD8+PD-1+T细胞是驻留的CXCR6+CD8+T细胞。通常CD8+T细胞可以识别MHC-Ⅰ呈递的抗原并激活相应的免疫功能，但CXCR6+CD8+T细胞是被白细胞介素-15（interleukin-6,IL-15）表达的FOXO1所激活，并且CXCR6+CD8+T细胞会释放TNF-α导致肝细胞的直接损伤和CD8+T细胞对肝细胞的黏附。CXCR6+CD8+T细胞激活的Fas配体途径的细胞凋亡也可以导致肝细胞死亡[12]。因此缺少免疫应答也是非酒精性脂肪肝演变为肝癌的一个重要原因，也是非酒精性脂肪肝相关HCC患者接受免疫治疗后效果不足的原因之一。

4 如何改善脂肪代谢提高免疫检查点抑制剂疗效

4.1 仑伐替尼与抗PD-1药物联合使用

对于使用酪氨酸激酶抑制剂的患者，仑伐替尼相较于索拉非尼能更好地与抗PD-1联合治疗[38]。一项比较索拉非尼和仑伐替尼作用的队列研究结果显示，对于非酒精性脂肪肝相关HCC患者来说，仑伐替尼的作用要优于索拉非尼。与不合并非酒精性脂肪肝的患者相比，非酒精性脂肪肝相关HCC患者的总生存时间和无进展生存期更长。同时，仑伐替尼作为小分子酪氨酸激酶抑制剂，可以抑制血管内皮细胞生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR）、成纤维生长因子受体（fibroblast growth factor receptor,FGFR）、血小板来源的生长因子受体（plateletderived growth factor receptor α,PDGFRα）和干细胞因子受体（stem cell factor receptor,KIT）[39]。同时，有研究通过动物实验表明，仑伐替尼通过抑制FGFR4来减少肿瘤PD-L1表达、Treg分化和浸润来提高抗PD-1治疗的疗效[40]。

4.2 PKCa抑制剂与抗PD-1药物联合使用

ZFP64可以激活CSF1促进肿瘤的发生并且形成免疫抑制的免疫微环境，而PKCa可以磷酸化锌指蛋白第226位丝氨酸，促进其核定位和泛素化，提示可以用PKCa抑制剂联合抗PD-1药物来改善疗效。根据临床队列回顾性研究，PKCa、ZFP64和CSF1信号轴的激活与不良预后相关，且对抗PD-1免疫治疗的效果呈负相关。作为一种PKCa抑制剂，Gö6976可以改善肿瘤微环境并且抑制肿瘤的发生[27]。而与索拉非尼相比，仑伐替尼也可以抑制PKCa并且抑制肿瘤的发生[41-42]。这也表明PKC激酶抑制剂，例如仑伐替尼和Gö6976，可以与抗PD-1药物联合使用治疗非酒精性脂肪肝相关HCC患者，以提高疗效。

4.3 PCSK9蛋白的抑制与抗PD-1药物联合使用

PCSK9抑制剂（伊洛优单抗、阿利西优单抗）阻断PCSK9介导的LDLR肝内降解，增加肝细胞表面LDLR的水平，从而增进低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的摄取和清除，降低血浆内LDL-C的水平。PCSK9基因缺失或使用PCSK9抗体抑制（伊洛优单抗、阿利西优单抗）可增加肿瘤细胞表面MHC-Ⅰ的表达，从而促进细胞毒性T细胞在肿瘤内浸润，抑制癌症小鼠模型中的肿瘤生长。MC38肠癌模型中，PCSK9抗体与PD-1抗体联合治疗组，有40%～50%的小鼠可达到长期无瘤生存[32]。

4.4 铁死亡诱导剂与抗PD-1药物联合使用

当脂质过氧化代谢的平衡被打破且积累到一定程度时，机体会发生铁死亡。临床研究发现，将铁死亡诱导剂和抗PD-L1药物联合使用时可提高抗肿瘤的效能[43-44]。肿瘤抗原特异性CD8+T细胞可以通过IFNy来引导肿瘤细胞铁死亡，并且花生四烯酸也参与了CD8+T细胞诱导肿瘤细胞铁死亡过程[43]。花生四烯酸不能单独诱导铁死亡，但当它在肿瘤微环境中与激活的T细胞分泌的IFNy共存时，可以通过ACSL4来诱导肿瘤细胞铁死亡。IFNy通过STAT1和IRF1信号通路来刺激ACSL4，ACSL4的表达和脂质代谢的改变可以诱导铁死亡，并且常见的C16和C18脂肪酸，如POA和OA也可以参与到这个过程[43]。提示未来临床治疗中将铁死亡诱导剂与抗PD-1药物联合使用，也许能提高非酒精性脂肪肝相关HCC的治疗效果。

4.5 HIF2a小分子抑制剂与抗PD-1药物联合使用

低氧诱发因子（hypoxia-inducible factors,HIFs）是一种在低氧状态下能够被激发的转录因子，并且HIF2a可以诱导肝脏组织的炎性反应发生，脂肪样变和纤维化[45]。近期一项研究表明HIF2a参与NAFLD演变为HCC的过程[46]。在非酒精性脂肪肝相关HCC患者中，有相当一部分HIF2a蛋白的表达上升，并且往往临床疗效不佳。而动物实验则表明，与野生型小鼠相比，肝细胞HIF2a基因敲除小鼠（hHIF2a-/-）肿瘤的数量和大小都明显减小[46]。HIF2a-YAP-c-Myc信号轴也许是HIF2a诱导癌症发生的关键机制。目前临床上已经出现了针对HIF2a的特异性小分子抑制剂，用于治疗其他肿瘤[47]，也许未来可与抗PD-1药物联合使用来改善非酒精性脂肪肝相关HCC免疫治疗的疗效。

4.6 诱导三级淋巴结构与抗PD-1药物联合使用

三级淋巴结构（termed tertiary lymphoid structures,TLSs）是在人出生后，非淋巴组织中形成的免疫细胞有组织的聚集体，三级淋巴结构在生理状态下不会出现，但是在一些慢性炎性反应环境下如慢性感染、自发性免疫性疾病和癌症状态下会发生[48]。既往研究表明，三级淋巴结构的出现往往与癌症更好的预后相关，并且针对部分癌症能够增强对免疫抑制剂的反应[49-52]。诱导TLS发生的治疗策略已在小鼠模型中证实[48]。现有证据表明，在乳腺癌和神经内分泌胰腺癌的小鼠模型中TLS可经诱导产生，并且有肿瘤遏制效应，其中PD-L1阻断与抗血管生成疗法结合，可以使肿瘤血管转化为高内皮细胞小静脉（high endothelial venule,HEV），伴随TLS形成，CD8+T细胞刺激上调和肿瘤破坏[53-54]。在黑色素瘤和尿路上皮癌的ICB治疗中发现，ICB治疗可以促进TLS的形成[50,55]，同时，也在人类癌症中观察到了不依赖ICB的TLS诱导，例如在患有高级别宫颈上皮内瘤变的患者中接种乳头瘤病毒癌蛋白疫苗后，可在消退后的病变中观察到TLS的形成[56]。但是目前尚未发现针对诱导TLS的发生与免疫抑制剂治疗肝细胞癌的相关研究。同时，诱导TLS发生也可能会发生一些免疫不良事件，因为TLS的诱导可能增强其他组织部位的自身反应性，如T和B细胞反应。免疫抑制剂本身会诱导自身免疫反应的发生，其毒性可能会导致关节炎、肌炎、甲状腺炎、血管炎和结肠炎，而TLS的诱导可能也会加重免疫毒性。虽然目前关于TLS形成和PD-1阻断后自身免疫性不良事件的报道很少，但已有报道表明TLS形成连同PD-1阻断与自身免疫性疾病发生相关[57]。因此，诱导三级淋巴结构与PD-1阻断剂联合使用治疗非酒精性脂肪肝合并肝细胞癌治疗策略的可行性还需要更多的动物实验和临床试验来证明。

5 总结与展望

近年来，免疫治疗在晚期肝细胞癌的治疗中扮演着越来越重要的角色。随着人们饮食和生活习惯的改变，肥胖相关的代谢疾病发病率逐渐增高，非酒精性脂肪肝合并HCC的患者数量逐渐上升。因此，了解非酒精性脂肪肝对HCC免疫检查点抑制剂疗效的影响十分必要。现有研究提示ICIs在非酒精性脂肪肝相关HCC中的疗效不如在病毒性HCC中有效。然而这只是假设，不足以得出最终结论，因为亚组分析容易产生偏倚，需要进行随机对照试验来进一步阐明。此外，未来的注册临床试验可考虑使用HCC病因学（病毒与非病毒）作为分层因素来进一步研究。

根据动物实验的结果表明，目前可能改善脂肪代谢并提高免疫抑制剂疗效的药物有仑伐替尼、PKCa抑制剂、PCSK9抑制剂、铁死亡诱导剂和HIF2a小分子抑制剂，其中仑伐替尼可以抑制FGFR4来减少PD-1的表达以及Treg分化，PKCa抑制剂可以抑制锌指蛋白64及其促进肿瘤微环境形成的作用，PCSK9抑制剂可以降低血浆内LDL-C的水平，铁死亡抑制剂通过ACSL4诱导肿瘤细胞死亡，而HIF2a小分子抑制剂则是通过抑制相应的信号轴来达到抗肿瘤效果。但是上述药物目前只在动物实验中证明了它们与免疫抑制剂合用可以改善小鼠NAFLD-HCC的治疗效果，是否能够在未来运用到临床中还需要进一步研究。TLS在抗肿瘤过程中起到积极作用，在部分癌症中TLS可以提高免疫抑制剂的疗效，诱导TLS在非酒精性脂肪肝相关HCC免疫治疗中的应用值得期待。