血清lncRNA MEG3的表达与多囊卵巢综合征患者胰岛素抵抗的关系

崔颍君，张华美，闫磊，王智，张春晓，隋清，王红梅，陈潇菲*

(德州市妇女儿童医院 1.检验科；2.产前诊断中心；3.内科；4.生殖健康科，德州 253000)

多囊卵巢综合征(PCOS)是生殖期女性最常见的内分泌疾病，也是导致不孕症的最重要原因[1]，PCOS以雄激素过多、排卵少和卵巢多囊性改变为特征。PCOS的全球患病率为6%～10%[2-3]，每15名女性中就有1人受到影响，超过三分之二的PCOS女性还表现出胰岛素抵抗(IR)和代偿性高胰岛素血症[4]，超出了由她们的肥胖程度所决定的水平，增加了这些女性患2型糖尿病和代谢综合征的风险[5]。

PCOS的发展是一个复杂的过程，涉及多种内外因素。除了编码蛋白质产物的mRNA外，人类基因组还转录大量非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)，这些ncRNA在所有或最关键的生理和病理过程中发挥关键作用。某些类型的ncRNA，如miRNA在PCOS中的表达模式和功能已被报道[6]。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是由200多个核苷酸组成的ncRNA的一个亚群[7]，目前关于lncRNA的研究较少。有研究表明lncRNA可直接与多个RNA分子或蛋白质作用，参与调控表观遗传、转录和转录后的基因表达[8]。lncRNA人类母系表达基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)是近年来新发现的一种ncRNA，有研究表明其在多种人类疾病中发挥着关键作用，可作为肿瘤治疗的靶点和预后判断的生物标志物[9]，而其与PCOS的关系尚不清楚。本研究通过检测血清中lncRNA MEG3的表达情况，分析lncRNA MEG3在PCOS病程发展中的作用及与IR的关系。

资料与方法

一、研究对象

选取2018年7月至2020年8月本院收治的PCOS患者为研究对象，进行前瞻性分析。

纳入标准：符合PCOS诊断标准[10]，符合下述3项中的2项：(1)有高雄激素的临床表现或高雄激素血症；(2)经过超声检查为卵巢多囊性改变，一侧或双侧卵巢内有≥12个直径为2～9 mm的卵泡，或卵巢体积≥10 cm2；(3)稀发排卵或无排卵。

排除标准：近期或长期服用激素类药物；合并子宫内膜异位症、卵巢早衰、恶性肿瘤、糖尿病、高血压等疾病；严重心、肝、肾等器官功能障碍；合并其他内分泌紊乱性疾病；临床资料不完整者。

共纳入符合标准的123例PCOS患者。根据胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)水平分为IR组(HOMA-IR≥2.69，n=54)和非IR组(HOMA-IR<2.69，n=69)。另选取同期来本院体检的健康女性85例为对照组。

本研究经我院道德伦理委员会批准通过。所有样本采集均取得受试者知情同意。

二、研究方法

1.主要试剂与仪器：Nano Drop 2000超微量分光光度计(Thermo Scientific，美国)；Abbott c16000全自动生化分析仪(雅培，美国)；Cobas e 601全自动电化学发光免疫分析仪(罗氏，瑞士)；RNA提取试剂盒(北京天根生化科技)；荧光定量PCR仪(Applied Biosystems，美国)；AceQ qRPCR SYBRGreen Mix(南京诺唯赞生物)。

2.血清采集：所有受试者在月经前3日采集空腹静脉血10 ml，置于促凝管中室温静置15 min后，3 500 r/min离心处理10 min，取上层血清置于EP管内，置于-80℃保存备用。

3.临床资料收集及生化指标测定：收集所有研究对象的临床资料，测量和记录年龄、身高、体重、体质量指数(BMI)、腰臀比(WHR)；采用全自动生化仪检测空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平；化学发光仪检测雌二醇(E2)、睾酮(T)、空腹胰岛素(FINS)；采用稳态HOMA-IR评价IR状况。HOMA-IR=FBG×FINS/22.5，HOMA-IR≥2.69定义为IR[11]。

4.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测血清中lncRNA MEG3表达水平：采用TRIzol试剂提取血清总RNA，检测纯度后取1 μg总RNA作为模板，采用反转录试剂盒进行反转录获得cDNA。以cDNA为模板进行扩增。反应体系为：正、反向引物各1 μl，AceQ qPCR SYBRGreen Mix 10 μl，50 ng/μl的cDNA模板1 μl，无RNA酶的灭菌水3 μl。反应条件：95℃下预变性10 min；然后以95℃ 30 s、95℃ 10 s、60℃ 15 s、72℃ 30 s的条件进行，共设35个循环。以GAPDH为内参基因，引物序列见表1。所有条件均按照检测系统严格进行。采用2-ΔΔCT法对血清lncRNA MEG3表达水平进行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

三、统计学分析

结 果

一、患者一般资料比较

共纳入符合标准的123例PCOS患者，其中非IR组(HOMA-IR<2.69)69例、IR组(HOMA-IR≥2.69)54例。

对照组、IR组、非IR组间年龄、BMI差异均无统计学意义(P>0.05)。WHR、TG、TC、LDL-C、FINS、T水平在IR组显著高于非IR组和对照组(P<0.05)，非IR组显著高于对照组(P<0.05)；HDL-C、FBG、E2水平在IR组显著低于非IR组和对照组(P<0.05)，非IR组显著低于对照组(P<0.05)(表2)。

表2 患者一般临床资料比较

二、各组中lncRNA MEG3和HOMA-IR水平比较

血清lncRNA MEG3水平在IR组显著低于非IR组和对照组(P<0.05)，非IR组显著低于对照组(P<0.05)；HOMA-IR水平在IR组显著高于非IR组和对照组(P<0.05)，非IR组显著高于对照组(P<0.05)(表3)。

表3 各组中lncRNA MEG3和HOMA-IR水平比较(-±s)

三、PCOS患者血清中lncRNA MEG3水平与HOMA-IR及其他生化指标的相关性分析

PCOS患者血清中lncRNA MEG3表达水平与HOMA-IR、WHR、TG、TC、LDL-C、FINS、T呈负相关(P<0.05)，与HDL-C、FBG、E2呈正相关(P<0.05)(表4)。

表4 PCOS患者血清lncRNA MEG3水平与相关指标的相关性

四、Logistic回归分析PCOS患者IR的影响因素

以是否发生IR为因变量，lncRNA MEG3、WHR、TG、TC、LDL-C、FINS、T、HDL-C、FBG、E2为自变量，进行Logistic回归分析。结果显示，lncRNA MEG3为PCOS患者发生IR的影响因素(P<0.05)(表5)。

表5 多因素Logistic回归分析IR的影响因素

五、血清lncRNA MEG3水平预测PCOS患者IR的诊断价值

绘制血清lncRNA MEG3表达水平预测PCOS患者IR发生的ROC曲线，其曲线下面积(AUC)为0.946[95%CI(0.889，0.978)]，对应的敏感度为98.15%，特异度为85.51%(图1)。

图1 血清lncRNA MEG3表达水平预测PCOS患者IR发生的ROC曲线

讨 论

PCOS作为一种常见的内分泌紊乱性疾病，见于约10%的育龄期女性中[12]。PCOS不仅是生殖内分泌疾病，也是代谢紊乱性疾病。PCOS患者常伴有肥胖，其内脏脂肪的增加降低了胰岛素的敏感性而导致IR发生[13]，IR可引起患者体内血糖、血脂代谢紊乱、雄激素升高，这也是患者发生代谢紊乱的初步表现，增加了糖尿病以及心血管疾病发生的风险，严重损害女性身心健康[12，14]。

研究表明lncRNA在PCOS的发生发展中发挥重要的调控作用[15]。lncRNA通常由200个以上的核苷酸组成，被称为内源性细胞RNA。越来越多的研究表明lncRNA是一种功能性分子，通过多种机制调控基本的生物过程，是发育、分化、细胞增殖以及凋亡的关键调控因子，并在糖尿病、心血管疾病和肿瘤等疾病的发生发展中产生重要影响[16-17]。MEG3是核苷酸长度大于1.6 Kb的lncRNA，位于人类染色体14q32上。MEG3可在多种正常组织中表达，如肝脏、胎盘、大脑、胰腺等。因为在一些肿瘤和肿瘤细胞系中发现MEG3表达的缺失，因此其被认为是一种肿瘤抑制因子，MEG3的过度表达会导致细胞生长停滞并促进细胞凋亡[18]。本研究结果显示，IR组患者血清lncRNA MEG3表达水平显著低于非IR组，非IR组又显著低于对照组；IR组的HOMA-IR水平显著高于非IR组和对照组(P均<0.05)；Pearson法相关分析表明PCOS患者血清lncRNA MEG3表达水平与HOMA-IR、WHR、TG、TC、LDL-C、FINS、T呈负相关，与HDL-C、FBG、E2呈正相关(P均<0.05)。提示lncRNA MEG3可能通过影响IR及血脂、激素水平，引发机体代谢紊乱，进而在PCOS的发生、发展过程中发挥一定作用。多因素回归分析发现lncRNA MEG3为PCOS发生IR的影响因素(P<0.05)；ROC曲线显示，血清lncRNA MEG3表达水平预测PCOS患者IR发生的AUC为0.946[95%CI(0.889，0.978)]，对应的敏感度为98.15%，特异度为85.51%。这些结果均提示lncRNA MEG3可能参与PCOS及IR的发生和发展，且可作为判断PCOS患者IR发生的血清学指标。

综上所述，在PCOS患者血清中lncRNA MEG3表达水平降低，且其表达水平与HOMA-IR呈负相关；lncRNA MEG3与IR发生以及血脂、激素水平异常密切相关，其可能通过与机体内糖脂等代谢异常相互作用进而影响PCOS的发生和发展。lncRNA MEG3有望成为判断PCOS疾病进展的血清学指标，但后续仍需要进一步完善研究设计加以探讨。