猪圆环病毒诊断方法研究进展

任慧波，李双寅，王 慧，李润成，杜丽飞，3※，邱光勇

（1.湖南省畜牧兽医研究所，湖南 长沙 410131；2.湖南农业大学，湖南 长沙 410128；3.湖南鑫广安农牧股份有限公司，湖南 长沙 410100；4.绥宁县良水冲生态种养专业合作社，湖南 绥宁 422604）

猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）为无囊膜，呈正二十面体，直径大小约为13～25nm，其DNA 基因组为环状单股负链的病毒，被列为圆环病毒科圆环病毒属，是目前已知的最小病毒之一。人们根据猪圆环病毒（PCV）致病性和抗原特异性存在差异的特点，将其划分为4 种基因型，主要为2 型导致猪发病。PCV2 主要感染宿主是猪，发病猪和无症状的隐性感染猪是主要传染源，感染途径主要是通过口鼻直接接触带毒的粪便、尿液或接触已感染PCV2 的病猪[1-2]等水平传播方式感染其他健康猪群。PCV2 同时也具有垂直传播的特性，在流产的胎儿、胎盘以及精液中均能检测到PCV2[3-4]。饲养环境卫生不合格、饲养管理不达标、引种不当、免疫性疾病混合感染等因素是诱发本病的原因[5-6]。

猪圆环病毒2 型主要是侵害猪只的免疫系统，使感染猪只的免疫功能受到损害，进而导致机体免疫抑制，诱发更多的相关疾病，且混合感染较多，该病毒通常以亚临床感染的形式出现而容易被忽视，为了更好地控制猪圆环病毒的感染和传播，迫切需要一些适合的快速准确的诊断方法应用于临床。但目前在诊断过程中，单一的诊断方法往往不能精准地诊断出该病，需要根据各种检测猪圆环病毒的方法及其优缺点进行结合分析并优化检测手段，为快速诊断该病及发展新型的诊断方法提供参考。

1 PCV2 病毒分离鉴定

病毒分离是PCV2 常用的诊断技术。伊秀凤等[7]将患有PMWS（断奶仔猪多系统衰竭综合征）猪的腹股沟淋巴结、肾脏等组织研磨，经生理盐水稀释、冻融、离心、取上清过滤等步骤，然后利用PCR 方法鉴定为PCV2 阳性，再取分离液接种于PK-15 细胞悬浮液中，经37℃培养，在悬浮液中形成细胞单层后，弃去生长液，将其加入D-氨基葡萄糖中处理，再将其置入新生仔猪血清的DMEM 维持液培养48h 后成功获得病毒,将获得的病毒放置在电子显微镜下可观察到无囊膜、呈正二十面体并呈散在分布的病毒粒子，即为PCV2 病毒粒子。PCV2 病毒分离存在分离步骤多、费时、费力等不便，不适用于临床上快速检测与诊断。

2 免疫组化

免疫组化又称免疫细胞化学技术（immunohistochemistry，IHC），该技术是运用抗原抗体的特异性反应的特征，用单克隆抗体或多克隆抗体在石蜡组织切片中检测某种抗原或抗体的分布情况，同时也用于抗原、抗体的定性、定量、定位的研究。该方法除了作为定性、定量检测的一种手段，可以利用定位病原在组织内的动态分布的特性，进一步了解病原的靶器官，为药物的开发打下良好的基础。Krakowka 运用IHC 方法对患有PMWS 猪群，发现淋巴细胞处有很强的PCV2 抗原阳性反应[8]。由于在实际操作中该方法较为繁琐且耗时长，需要避免过氧化物酶的干扰，因此IHC 不能用于大规模检测中，在对抗原组织或细胞大体形态的评价的应用相对较多。

3 间接免疫荧光技术（IFA）

间接免疫荧光技术常用于病原体的诊断检测以及病原体引起的肾炎、皮炎等疾病的免疫病理学检查，猪源细胞PCV2 感染情况检测、鉴定圆环病毒的分离效果及相关病变组织的检测等均需要运用到该技术。芦银华等[9]以PK-15 细胞增殖的PCV2 标准毒株作为包被抗原成功建立起用于检测PCV2 抗体的IFA 方法，运用已建立的方法来检测多地的血清样品，结果显示PCV2 抗体阳性率达到59%，检测过程中未见到PRRSV、PRV、PPV 抗体所产生的特异性荧光，表明该方法具有良好的特异性。

4 环介导等温扩增技术（LAMP）

2000 年一种新的核酸诊断技术-环介导等温扩增技术（LAMP）被用于临床中，其特点是针对靶基因的6 个区域设计4 种特异引物，利用一种链置换DNA 聚合酶在等温条件(63 ℃左右) 保温30～60 分钟，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR 相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。LAMP 是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR 技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。Chen 等[10]成功建立一种新的PCV2 LAMP 检测方法，与PRRSV、PRV、PCV1 不出现交叉性。

5 酶联免疫吸附试验（ELISA）

酶联免疫吸附试验是以酶分子与抗体或抗抗体的共价结合，并通过显色反应测定吸光度判断是否出现免疫反应的一种检测方法。在众多血清学检测方法中，ELISA 检测方法可以弥补间接免疫荧光技术（IFA）、病毒中和试验测定法、免疫过氧化物酶单层细胞试验等存在费时、劳动强度大等不足，凭借着操作简单、敏感性高、易于自动化、适合大规模检测等诸多优点，ELISA 成为使用最广泛的血清学检测方法，能用于多种疾病的血清学检测。国内外学者已建立多种ELISA 检测方法，主要有竞争ELISA、间接ELISA、双抗体夹心ELISA、抗原捕获ELISA。

5.1 间接ELISA

间接ELISA 是指在固相载体表面包被抗原。国外学者报道两种PCV2 间接ELSIA 检测方法[11],一种以细胞培养的PCV2 全病毒作为包被抗原用于检测全病毒的抗体，即为PCV2 ELISA；以ORF2 重组杆状病毒表达产物作为包被抗原用于检测Cap 蛋白的抗体，即为ORF2 ELISA。间接ELISA 具有良好的重复性和特异性，但由于其不能有效识别PCV1和PCV2 的抗体，严重影响了其在生产实际中的应用。杨顺利等[12]利用可溶性重组PCV2-Cap 蛋白肽段为抗原，建立PCV2 血清抗体间接ELISA 检测方法（rhcap-ELISA），运用该方法跟同类商品化试剂盒进行对比试验，对送检的137 份血清进行检测，结果显示两种检测试剂盒的阳性检出率分别为79.56%和83.21%，该重组抗原与PRRSV、CSFV、PRV 等阳性血清不发生交叉反应，具有很强的特异性，可用于大规模的PCV2 抗体大规模检测工作。

5.2 竞争ELISA

Walker 等[13]首次建立用于检测PCV2 抗体的竞争ELISA,对来自法国、英国、加拿大等国的484份感染PCV2 的血清进行检测，通过与IFA 检测方法进行对比发现，该方法和IFA 检出PCV2 的抗体阳性率分别为99.58%、97.14%，表明该方法的特异性和敏感性高于IFA，且差异小。王洪利等[14]建立以PCV2 特异性单克隆抗体为竞争试剂的阻断ELISA，与间接ELISA 相比具有明显的优势，能有效反映猪群感染状况或疫苗效力。

5.3 抗原捕获ELISA

2002 年，McNeilly 等[15]基于单抗建立起的抗原捕获ELSIA 可用来检测PCV 的复制位点和PMWS的检测，也可用于病毒的纯化。

6 聚合酶链式反应（PCR）

6.1 普通PCR

普通PCR 是圆环病毒常用的一种诊断方法，其原理是根据目的基因片段设计引物，在PCR 仪器的作用下将病料中的PCV2 特异的基因组片段扩增出来，以此达到检测样本中PCV2 的目的。普通PCR 目前在生产实际中大量应用，施研进等[16]成功建立PCR 检测方法，并对来自新疆石河子及北屯地区的203 份抗凝血液进行检测，共检测阳性样本16 份，阳性率为7.9%。李英等[17]以PCV2 病毒的ORF2 基因设计出特异性引物，建立检测PCV2 病毒的PCR 方法，对来自山东日照患有PMWS 的10头猪进行检测，结果显示有7 头呈现阳性。该检测方法具有快速、简便、特异性强的优点，因其在扩增后需凝胶电泳检测和成像系统的判定，在检测过程中容易受到污染，进而造成假阳性。

6.2 多重PCR

多重PCR 是指设计两种以上的引物，再在同一个PCR 反应体系中可以扩增出多个病原核酸片段的PCR 技术。因PCV2 易与其他病原发生混合感染进而引发综合病症，相比单重PCR，利用多重PCR可以一次性扩增出多个病原的核酸片段，达到对多种疾病检测诊断的目的[18]。辛长勋等[19]根据GenBank中已发表猪圆环病毒2 型（PCV2）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）相关的基因序列排列情况，自行设计3 对引物，通过生物公司合成引物，通过优化试验成功建立检测三种病毒的多重PCR 检测方法，对临床87 份样本进行病原检测，3 种病毒检出率分别为28.75、11.5%、12.6%；2 种病毒混合感染的阳性率为13.8%，3 种病毒同时感染的阳性率为2.3%，实现对多种病原检测的目的。

6.3 荧光定量PCR（qPCR）

荧光定量PCR（qPCR）是通过收集不断累积的荧光信号来对PCR 扩增进行监测，然后根据已建立的标准曲线对模板进行定量定性分析。qPCR 是依据试验建立的标准曲线及样品的Ct 值[20]，通过计算得到起始拷贝数，从而实现定量定性的目的。Ct 值（Cycle threshold，循环阈值）是荧光信号达到阈值时所需的循环数，与样本中的起始拷贝数的对数存在明显的线性关系，起始拷贝数越大则Ct 值越小，反之Ct 值越大[21]。阈值（threshold）一般为3～15 个循环的荧光信号的标准差的10 倍（threshold=10×SD threshold 3～15），当荧光信号超过阈值时才视为真正的信号[22]。qPCR 技术继承普通PCR 的灵敏性、特异性的同时将光谱技术的精确定量有效结合起来，在无需凝胶电泳和成像技术的配合下，可以直接探测模板扩增时荧光信号的变化[23]，能快速、准确得到扩增结果。与普通PCR 相比，荧光定量PCR 因反应过程处于完全密闭状态，能减少因实验室污染造成的假阳性的发生率进而保障试验的准确性。目前为止qPCR 方法有两类，即使用特异双链DNA 结合染料的SYBR Green I 染料法和建立在荧光共振能量转移原理上使用荧光探针的TaqMan 探针法。董林等[24]成功建立SYBR Green I 荧光定量PCR，该方法检测极限为3.21×100copies/μL，灵敏度是普通PCR 的1000 倍，对临床样品收集的PCV2 疑似病料检测表明阳性检出率为58.94%，阳性检出率明显高于普通PCR。任方方等[25]建立TaqMan 探针荧光定量PCR，该方法的检测极限和定量极限分别为10copies/μL和100copies/μL，利用建立的荧光PCR 对1000 份临床样品检测，710 份样品检出为阳性，PCV2 阳性率为71%。qPCR 因其结果更直观、敏感性更高、特异性更强等优点，更适用于猪场PCV2 病毒的长期监测。

7 小结

病原的快速准确地诊断是解决各类传染病的决定性因素。自猪圆环病毒发现以来，国内外对其检测方法进行了大量的研究，已经建立了多种PCV2 检测方法，但各种方法都有其局限性，无论哪一种检测方法都不能彻底解决所有的问题。我国虽然在PCV2 的研究方面有了较大的进展，但检测体系尚不够完善。因此在实际应用过程中，有必要根据检测的目的和要求，结合自身的经验和具备的实验条件设施，选择适宜的检测方法，同时进一步加强对PCV2 的检测尤其是分子生物学检测和免疫学检测的研究，为PCV2 的防控带来更多的便利。