酵母衍生物在果酒中的应用进展

陈晓姣，刁体伟，赖晓琴，冷银江，魏鑫，马懿

(四川轻化工大学 生物工程学院，四川 宜宾，644005)

酵母衍生物是通过在富含糖的培养基中培养酿酒酵母，之后通过自溶、质壁分离、水解等过程，再经过浓缩或干燥处理获得的商业酵母制剂[1]。根据生产工艺、成分以及纯化程度的不同，酵母衍生物可分为四类：灭活的干酵母、酵母自溶物、酵母细胞壁、酵母提取物[2]；根据酵母衍生物在果酒中的应用不同可分为：酒精发酵促进剂、乳酸发酵促进剂及果酒品质改良剂[3]；根据酵母衍生物释放的功能性物质不同主要可分为富含谷胱甘肽(glutathione，GSH)及富含甘露蛋白两大类[1]。

酵母衍生物制剂在酿酒过程中的应用，主要包括以下几个方面：促进发酵进程，提高果酒中酒石酸盐和蛋白质的稳定性；除去部分不理想的酒类成分[3]；含有来源于酵母的硫化合物，能作为抗氧化剂应用到果酒酿造中[4]；缩短果酒陈酿时间及提高果酒品质[5]。表1依据酵母衍生物在果酒中的不同功能列举了商业酵母衍生物在酿酒行业的应用情况举例及作用说明。

1 酵母衍生物释放的功能性物质及其作用

在果酒酿造中，酵母衍生物因多糖含量高、富含多肽成分等具有广阔的应用前景[2]。其释放的众多化合物中，应用最广泛的是甘露蛋白和GSH[5]。

1.1 GSH的特性及结构

GSH是一种天然抗氧化物，广泛存在于酵母、葡萄等果实中，由L-谷氨酸、L-甘氨酸和半胱氨酸组成，其半胱氨酸上连接的巯基具有独特的氧化还原与亲核特性，它能清除自由基、捕获邻醌[6]，防止葡萄酒氧化褐变，对葡萄酒香气成分具有显著的保护作用[4]。GSH在机体内具有2种存在形式：还原型GSH和GSH二硫化物(glutathione disulfide，GSSG)，其结构形式如图1所示，2种形式可以自由转换。酵母中谷胱甘肽循环路径如图2所示。GSH由谷氨酸和半胱氨酸通过2个消耗ATP过程合成，分为2个步骤。第一步，由GSH1编码的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化谷氨酸和半胱氨酸形成二肽γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-Glu-Cys)，此步骤是限速步骤，能通过合成的终产物GSH抑制反馈[7]；第二步，谷胱甘肽合成酶(GSH2)催化二肽与甘氨酸连接。在机体发生氧化应激反应时，通过与自由基反应、谷胱甘肽过氧化物酶或谷胱甘肽S-转移酶的催化作用，GSH被氧化为GSSG；而GSSG可通过GSH还原酶(glutathione reductase，GR)的作用，在NADPH辅助下转化为还原型GSH[8]。

a-GSH；b-GSSG图1 还原型GSH和GSSG分子结构Fig.1 Molecular structures of reduced GSH and GSSG

图2 谷胱甘肽循环路径Fig.2 Cycling pathway of glutathione

1.2 富含GSH的酵母衍生物(g-IDY)

2015年第38届世界葡萄与葡萄酒大会暨第13届国际葡萄与葡萄酒组织大会通过的两项决议规定了在葡萄酒中GSH的最大使用剂量为20 mg/L，但欧洲食品添加剂法规还不允许在酿酒中直接添加GSH。富含GSH的酵母衍生物制剂可作为在酿酒和装瓶过程中不直接添加GSH而增加还原型GSH浓度的一种天然方法[1]，但其添加标准及释放的功能性物质含量均缺乏理论及实践研究。

SONNI等[9]在加速氧化条件下，加入g-IDY到模型酒中，由于游离的巯基具有较强的还原性，能够延缓模型白葡萄酒的褐变。此外，PAPADOPOULOU等[10]发现GSH在陈酿过程中对香味物质具有保护作用，尤其是挥发性成分酯、萜烯和硫醇，也能减少一些非典型的风味成分。有研究人员发现加入与g-IDY释放的同等量的纯GSH对葡萄酒香气成分特别是挥发性硫醇的影响却不是特别明显，这可能是由于酵母释放的其他物质与GSH共同作用对葡萄酒产生的积极影响。

1.3 纯化甘露蛋白

甘露蛋白在果酒酿造过程中产生量和释放量取决于酵母菌株类型和营养条件[11]。甘露蛋白占酿酒酵母细胞壁成分的35%～40%，是一种糖蛋白，甘露蛋白含有超过90%的糖，主要是甘露糖，通常高度糖基化且糖基化程度不同，位于酵母细胞壁的最外层[12]。根据甘露蛋白与细胞壁结合的形式，分为3种类型:非共价结合和与细胞壁的葡聚糖共价结合以及通过二硫键与其他蛋白质结合，而这些蛋白质本身又与葡聚糖共价结合[13]。作为一种有效的生物乳化剂，甘露蛋白能部分水解，在酒精发酵过程中，尤其是在酒精发酵完成后，通过β-1,3葡聚糖酶的作用释放出来。甘露蛋白使酵母细胞壁具有活性并在很大程度上决定了细胞壁孔隙大小，从而调节蛋白质等功能物质的释放，以及大分子物质从环境中进入细胞内。

欧盟在2005年颁布的法规(Council Regulation (EC) 2165/2005 of 20 December 2005 amending Regulation (EC) 1493/1999 on the common organization of the market in wine)中规定，可直接在酿酒中使用甘露蛋白作为酿造添加剂。甘露蛋白作为酵母释放的最具有研究意义的多糖成分，是由于甘露蛋白能与果酒中酚类化合物作用，限制单宁的自我聚合作用，从而产生更稳定的聚合物结构[14]。

2 酵母衍生物在果酒酿造中的应用

酵母衍生物在不同果酒酿造中的应用情况举例见表2。

2.1 作为酒精发酵促进剂

酵母作为引导酒精发酵进程的主要微生物，其所需营养物质水平决定了发酵进程速率。据研究，低水平的氮化合物可导致低发酵速率甚至发酵停滞[21]。此外，乙醇、中链脂肪酸等酵母菌在发酵过程中的代谢产物也可能导致这些现象，卢新军等[22]研究得到在酒精发酵过程中添加酵母细胞壁提取物可促进酵母的生长，减轻乙醇等代谢产物对酵母的毒害作用。大多数酵母衍生物制剂主要由酵母细胞质代谢物(蛋白质、肽、氨基酸、多糖包括甘露蛋白、固醇和脂肪酸)、不溶性成分(主要是纤维素)、维生素和矿物质[4]组成，这些营养物质不仅满足了酵母的生长代谢需要还能促进酵母中GSH前体物质的合成、合成还原型GSH，研究还发现在原料及生产工艺不变的条件下，酒体中GSH含量主要由酵母代谢所决定，环境中GSH浓度越高，酵母胞内GSH含量也越高[16]，从而促进发酵进程。酵母衍生物制剂富含的高甾醇含量也是提高酒精发酵速率的另一原因，高甾醇含量可增加酵母细胞膜的渗透性，使得细胞和培养基之间物质交换速率更高，发酵过程得以顺利进行[23]。祝霞等[24]发现添加甘露聚糖可缩短酵母生长的迟滞期，能显著提高酵母细胞活力，促进酵母菌株快速生长和繁殖，也验证了酵母衍生物制剂作为酒精发酵促进剂的作用。

表2 酵母衍生物在果酒酿造中的具体应用情况举例Table 2 The application of yeast derivatives in fruit winemaking industries

2.2 作为乳酸发酵促进剂

乳酸发酵不仅能降低果酒总酸度，还在提高果酒的稳定性和感官特性中起关键性作用[14]。但乳酸发酵进程非常缓慢，导致果酒很可能被微生物污染，出现常见的“酸败”现象[25]。研究表明，一些酵母衍生物可以通过释放游离氨基酸和多肽等化合物来促进乳酸菌的生长[26]，从而促进乳酸发酵进程。LONVAUD-F等[27]等发现添加0.2 g/L的酵母壁成分制剂能促进乳酸菌的生长，也有EDWARDS[28]发现酵母尸体能吸附一些对乳酸菌有害的中链脂肪酸，为乳酸菌提供有益的生长环境；乳酸菌还能分解酵母释放的甘露蛋白[11]，从而为其自身生长代谢提供营养。酵母衍生物释放的其他成分，如脂类、维生素和核苷酸，也在乳酸发酵中起到了积极作用[26]。

但值得注意的是，使用酵母衍生物为酵母补充营养提高酒精或乳酸发酵速率的同时，可能会对果酒的组成成分产生不良影响。有证据表明，补充酵母自溶物会导致酒糟中具有高浓度的生物胺，这些生物胺会影响葡萄酒的组成成分[29]。另外，使用酵母提取物也可能存在不溶性问题，对果酒的品质产生影响。这也对建立酵母衍生物制剂的使用标准、丰富酵母衍生物制剂理论和实践数据提出了迫切需求。

2.3 保护果酒成分及提高感官特性

酵母衍生物制剂可以保护或提高果酒有益成分含量，提高感官特性也是其功能性的主要表现方面，但是其作用机理还不是很明确。比如，早期研究发现，酵母细胞壁和酵母甘露蛋白可以与果酒中的香气化合物结合[30]，形成更稳定的化合物，防止香气成分的损失。但从两种不同的酿酒酵母的自溶产物中分离出来的甘露蛋白，添加到葡萄酒中，其结合能力却表现不同[31]，这可能是由甘露蛋白纯度不同导致的。

2.3.1 稳定果酒色泽

良好的色泽是果酒感官品质的重要特征之一。稳定葡萄酒色泽的前提是防止其氧化褐变。有研究表明，由酵母衍生物制剂释放的较高浓度的还原型GSH起到了抗氧化保护作用。在酵母中，GSH约占酵母干重的1%，占低分子硫醇的95%以上，酵母细胞中高浓度GSH(10 mmol/L)及其低氧化还原电位(E0=-240 mV, pH= 7)的特点使其作为氧化还原缓冲剂参与到众多反应中(氧化还原、抵抗外源性药物毒性和重金属等胁迫环境)，也在维持细胞结构完整性等基本功能方面发挥作用[32]。也有研究发现，在葡萄酒装瓶前添加10 mg/L的GSH，可以防止葡萄酒氧化，保护葡萄酒的色泽和一些香气化合物，减少引起异味的化合物产生[33]。但对葡萄酒产生良好效果所需要的的最佳剂量及其他酿酒参数如温度、pH对酵母衍生物制剂释放GSH含量的影响是未知的。另外，不同酵母菌株所制成的衍生物制剂释放到酒中的GSH含量差别在40～80 μmol/L，3个月后在30～50 μmol/L[34]，这也为GSH的应用造成一定困难。

酵母衍生物释放的多糖成分，也能保护果酒色泽。它们与单宁、花青素相互作用，促进色素聚合物的形成、防止聚集沉淀现象，从而使果酒颜色长时间具有更好的稳定性。已有相关研究证实在葡萄酒酿造、后浸渍及过滤阶段添加酵母衍生物制剂能代替传统的酒泥陈酿方式，增加果酒中多糖浓度及葡萄酒香气复杂性，提高葡萄酒色泽稳定性[35]。RINALDI等[25]还发现甘露蛋白对葡萄酒颜色变化的影响差异主要取决于不同品种葡萄所导致的多酚成分差异，而非商业甘露蛋白的配方，因此，可推测对于甘露蛋白酵母衍生物制剂的使用，应主要关注果酒所用原材料种类不同所导致的成分差异。

2.3.2 降低果酒涩感

据了解，由于原花青素与口腔内的唾液蛋白相互作用，产生不溶性聚集物、沉淀，从而降低对上颚的润滑作用，导致涩味的产生。多糖对涩感的影响机制：一方面是由于酵母衍生物释放的多糖成分可阻止原花青素的聚集，能降低果酒的涩感(包括程度和持续时间)[36]；另一方面，多糖与多酚类物质发生竞争性结合，阻止了酚类物质与蛋白的相互作用；还有学者认为是多糖通过形成蛋白-多酚-多糖三元复合物增强了在水溶液中的溶解度，而多糖的抑制效果取决于唾液蛋白和单宁的种类[35]。另外，同时添加酵母衍生物制剂和β-葡聚糖酶，可以改善葡萄酒的颜色，释放更多的多糖物质，从而降低葡萄酒的涩味。但也有研究表明，添加水解酶制剂(主要是聚半乳糖醛酸酶、果胶酶和其他二级活性物质如蛋白酶、半乳糖醛酸酶和纤维素/半纤维素酶)有助于颜色的形成以及增加葡萄中多糖含量，但也可能导致成酒较高的单宁含量及涩感更强烈。因此，添加水解酶制剂对果酒的影响应进一步深入研究。

2.3.3 对果酒其他感官特性的影响

酵母衍生物对果酒其他感官特性的影响主要体现在对果酒色泽、香味的修饰保护作用，去除不良物质、异味成分等。研究发现酵母细胞壁具有结合花青素的能力，主要与花青素的酰基衍生物结合，对红酒色泽具有修饰保护作用[37]。RAZMKHAB等[38]发现酵母和酵母细胞壁能吸附白葡萄酒中的酚类物质和褐变产物，更好的维持果酒品质。还有研究学者认为酵母衍生物可以用来去除一些抑制酒精发酵的化合物，如发酵过程生成的短链脂肪酸。CHALIER等[31]提出当甘露蛋白质量浓度为150 mg/L时，能够与葡萄酒中的芳香化合物结合，从而起到保留香味成分的作用，并且认为甘露蛋白分子的糖苷和肽都参与了与香味分子的相互作用，其作用效果取决于甘露蛋白的类型和酵母菌种。还有研究认为，由于酵母壁具有吸附能力，因此，可以用来去除或减少葡萄酒异味。

2.3.4 提高果酒安全性

果酒可能存在的安全隐患包括OTA污染、重金属污染等。OTA是一种危险的真菌次生代谢产物，欧盟在2006年颁布的法规1881/2006中规定“葡萄酒中的OTA含量上限为2 μg/L”，因此，选择合适的方式控制果酒中OTA含量成为了亟需解决的难题。随着SCOTT等[39]1995年首次观察到在发酵过程中，添加3种不同的酿酒酵母菌株到麦汁中，能将OTA含量减少21%以来，越来越多的研究者通过使用酵母[40]、酵母细胞壁[41]或酵母细胞壁提取物达到降低OTA的目的。MORUNO等[42]发现添加20 g/L的酵母渣(主要由酵母壁组成)在7 d后能降低葡萄酒中高达70%的OTA含量，UMMARINO等[41]也发现在白葡萄酒中由于多酚和OTA在酵母细胞表面相同的结合位点上存在竞争现象，进而显著的降低OTA水平。已有研究表明，酵母壁中的几丁质可以降低葡萄酒中的OTA水平[43]、甘露蛋白由于其结合能力，在去除OTA过程中也发挥了重要作用[44]，另外，OTA能自发吸附在酵母细胞壁上[45]。

葡萄酒中还可能存在其他一些有毒物质，如重金属(铅、镉)等，铅对人体内的多种酶系统产生不利影响，镉能使含有巯基的酶失活。BORNET等[43]发现，真菌细胞壁的几丁质能减少这两种重金属含量。此外，过量的铁(>10 mg/L)会导致果酒稳定性较差，因为铁化合物氧化后，会导致色素的沉淀。因此，为了酿造出稳定的葡萄酒，在装瓶前，铁的含量必须低于5 mg/L。酵母衍生物制剂的使用，可在去除这些有毒或对酒品质产生不良影响的物质方面有良好效果。

3 总结与展望

目前，不同酵母衍生物制剂在果酒酿造中取得了良好的应用成果，酵母衍生物制剂的商业化已获得了较快的发展。其对发酵工艺的改进和酒的感官、安全性能方面的提高是其快速增长的主要原因，但其广泛应用仍然存在一些不可忽视的问题。首先，尽管已有很多研究表明，在果酒中加入酵母衍生物会提高其感官特性，但这种效果是由酵母衍生物本身释放的气味化合物产生还是其对果酒本身香气化合物的修饰改变所导致的尚不明确；第二，添加相同量的不同种类酵母衍生物，对果酒化学成分、代表性的挥发性呈香物质的作用效果都不一样；第三，目前关于酵母衍生物的应用大多都是通过小酒窖试验，而不是通过建立较完善的科学实验所获得的研究结果。这也导致大多数果酒制造商都是通过经验来选择酵母衍生物产品种类以及添加剂量。因此，对不同酵母衍生物制剂化学组成成分的研究变得尤为重要，建立酵母衍生物制剂统一使用标准也是今后研究工作的重点。

今后，对酵母衍生物制剂的研究还应考虑在发酵开始时添加或在浸渍过程中添加对后续步骤(如乳酸发酵)的影响，不同时段添加对果酒氧化性、稳定性等的影响。另外，在这一领域的应用研究需要创新。比如，将酵母衍生物制剂(如富含GSH非活性干酵母)与其他方法联合使用(如物理方法：超高压处理、高压脉冲电场处理，化学方法：添加壳聚糖等)作为果酒中添加SO2的替代方法，研究其对果酒感官品质、贮藏性能等方面的影响，使其获得更好的应用价值，也为减少果酒中SO2的使用提供更多的可能性。