3种百合属植物鳞茎甲醇提取物中酚类物质抗氧化活性及黄酮类及相关化合物的组成和代谢分析

徐 倩， 孙泽晨， 龙 月， 张 璐， 潘远智，②， 李 青

(1. 四川农业大学风景园林学院， 四川 成都 611130； 2. 广元市住房和城乡建设局， 四川 广元 628017；3. 西藏自治区农牧科学院， 西藏 拉萨 850030)

百合属(LiliumLinn.)植物隶属于百合科(Liliaceae),为多年生球根草本花卉，全世界约115种，中国约55种，中国是百合属资源的分布中心[1]。国内历来将龙牙百合(L.browniivar.viridulumBaker)、宝兴百合(L.duchartreiFranch.)和岷江百合(L.regaleWilson)用作观赏植物和药用植物，其中，龙牙百合是三大主栽食用百合之一[2,3]，而宝兴百合和岷江百合虽有广泛应用，但二者的生物活性成分却鲜有研究。近年来，百合属植物因鳞茎富含酚类物质并具有较强的抗氧化活性越来越受欢迎[4]，被广泛用于人体疾病治疗和食品保健。黄酮类化合物是酚类化合物中分布最广的一类化合物，同时也是在植物中广泛分布的次生代谢产物。由于人体自身不能合成黄酮类化合物，因此植物中的黄酮类化合物对人体非常重要[5]。

百合属植物中生物活性成分的分析和检测已成为近年来的研究热点。大量研究利用高效液相色谱(HPLC)、超高效液相色谱-电喷雾三重四级杆质谱(UPLC-TQ-MS)、顶空固相微萃取和气相色谱-质谱联用技术(HS-SPME-GC-MS)及高效液相色谱-串联四级杆飞行时间质谱(HPLC-Q-TOF-MS)分析百合属部分植物的化学成分[4，6-8]。已报道百合属植物中黄酮类化合物不足50种，占黄酮类化合物总数的0.5%以下。近年来，超高效液相色谱-电喷雾电离-串联质谱(UPLC-ESI-MS/MS)的广泛靶向代谢组学分析因其高通量、快速分离、高灵敏度和广泛性而成为植物代谢物分析和鉴定的热点[9]，该技术已应用于拟南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕[9]、柑橘(CitrusreticulataBlanco)[10]和苦荞麦〔Fagopyrumtataricum(Linn.) Gaertn.〕[11]等植物。

百合属植物为传统的药食同源植物，但目前对其药用和食用价值的研究仅限于少数种类[12]，且具体组成成分和作用机制尚不明确。四川作为中国百合属植物野生资源的主要分布地区，百合属植物资源丰富。本研究采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)集成检测系统，比较四川部分地区龙牙百合、宝兴百合和岷江百合鳞茎甲醇提取物中酚类物质的抗氧化活性，分析其中黄酮类及相关化合物的组成，并进行差异代谢物筛选、功能注释和富集分析，以期为兼具食用和药用价值的百合新品种选育奠定工作基础。

1 材料和方法

1.1 材料

供试龙牙百合鳞茎购自四川省松花岭农业开发有限公司，宝兴百合采自四川省宝兴县明礼乡庄子村(东经102°47′、北纬30°38′)，岷江百合采自四川省黑水县龙坝乡黑瓦村(东经102°32′、北纬31°35′)，经四川农业大学潘远智教授鉴定。于2016年10月种植于四川农业大学成都校区(东经103°57′、北纬30°38′)四教实验大棚中，棚内温度22 ℃～35 ℃，空气相对湿度(68±2)%。于2017年10月挖出鳞茎，每种选取大小基本一致的鳞茎30个，平均分成3份，即为3次重复。鳞茎用清水洗净后风干，然后用电动研磨机研磨成粉后过筛(孔径1 mm)，于-80 ℃冰箱保存、备用。

1.2 方法

1.2.1 样液制备 称取供试样品粉末100 mg，用1 mL体积分数70%甲醇-水溶液溶解后，于4 ℃冰箱过夜后涡旋3次，每次30 s，间隔1 min，然后于4 ℃、10 000g离心10 min，取上清液，用微孔滤膜(孔径0.22 μm)过滤后保存于进样瓶中，用于UPLC-MS/MS分析。

1.2.2 指标测定

1.2.2.1 总酚、总黄酮和总黄烷醇含量测定 参考王乐等[13]的方法测定总酚含量，采用氯化铝(AlCl3)比色法[14]测定总黄酮含量，采用香草醛比色法[15]测定总黄烷醇含量。

1.2.2.2 抗氧化活性测定 参照Dudonné等[16]的方法测定DPPH·清除能力，参照周海玲等[17]的方法测定铜离子还原能力。

1.2.2.3 黄酮类及相关化合物测定 参考Zhou等[18]的方法，采用UPLC-MS/MS集成检测系统对黄酮类及相关化合物进行定性和定量分析。

上述指标均重复测定3次。

1.3 数据统计分析

采用多维统计分析，建立可靠的数学模型对黄酮类及相关化合物进行分析。参考赵君等[19]的方法，利用主成分分析(PCA)对3种百合属植物样本间代谢物总体差异和组内样本间的贡献率进行分析，利用偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)区分组间黄酮类及相关化合物的总体差异，寻找差异代谢物，变量重要性投影值(variable importance in projection，VIP)大于1的变量被认为是差异变量。差异倍数(fold change，FC)经log2转化，选取VIP>1，log2FC≥2.0或log2FC≤0.5，P<0.05的黄酮类及相关化合物为差异代谢物。

采用IBM SPSS Statistics 19.0软件进行Pearson相关性分析和主成分分析。

2 结果和分析

2.1 3种百合属植物鳞茎甲醇提取物中酚类物质含量和抗氧化活性的比较

3种百合属植物鳞茎甲醇提取物中酚类物质含量和抗氧化活性的比较结果见表1，相关性分析结果见表2。

2.1.1 酚类物质含量的比较 由表1可见：岷江百合鳞茎甲醇提取物中总酚、总黄酮和总黄烷醇含量均最高，分别为41.337、7.415和1.139 mg·g-1，显著(P<0.05)高于龙牙百合和宝兴百合，且龙牙百合鳞茎甲醇提取物中总酚和总黄烷醇含量显著高于宝兴百合，但二者间总黄酮含量无显著差异。

表1 3种百合属植物鳞茎甲醇提取物中酚类物质含量和抗氧化活性的比较

2.1.2 抗氧化活性的比较 由表1还可见：岷江百合鳞茎甲醇提取物的DPPH·清除能力和铜离子还原能力分别为46.156和2.046 μmol·g-1，显著高于龙牙百合和宝兴百合，且后二者间无显著差异，说明岷江百合鳞茎甲醇提取物的抗氧化活性最高，龙牙百合和宝兴百合鳞茎甲醇提取物的抗氧化活性相对较低。

2.1.3 酚类物质含量和抗氧化活性的相关性分析由表2可见：3种百合属植物鳞茎甲醇提取物的总酚含量、总黄酮含量、总黄烷醇含量、DPPH·清除能力和铜离子还原能力间均呈极显著(P<0.01)正相关，相关系数为0.956～0.990。

表2 3种百合属植物鳞茎甲醇提取物中酚类物质含量和抗氧化活性的相关性分析1)

2.2 3种百合属植物鳞茎甲醇提取物中黄酮类及相关化合物的组成和主成分分析

2.2.1 黄酮类及相关化合物的组成 采用UPLC-MS/MS和多种数据库，在3种百合属植物鳞茎甲醇提取物中鉴定出86种黄酮类及相关化合物，包括黄酮类67种、酚酸类14种、香豆素4种和生物碱1种，其中黄酮类包括花青素4种、黄酮44种、二氢黄酮12种、黄酮醇5种和查尔酮2种，聚类热图见图1。由图1可见：龙牙百合、宝兴百合和岷江百合鳞茎甲醇提取物中黄酮类及相关化合物的组成差异较大，其中，岷江百合中超过一半的黄酮类及相关化合物的相对含量高于龙牙百合和宝兴百合。

图1 3种百合属植物鳞茎甲醇提取物中黄酮类及相关化合物的聚类热图

2.2.2 黄酮类及相关化合物主成分分析 主成分分析结果显示：本研究提取PC1和PC2 2个主成分，分别占比56.0%和28.4%，累计贡献率达84.4%，说明各组样本之间的总体代谢差异和组内样本之间的变异度较小。

2.3 3种百合属植物鳞茎甲醇提取物中黄酮类及相关化合物的PLS-DA分析

采用PLS-DA分析对3种百合属植物鳞茎甲醇提取物中黄酮类及相关化合物相对含量进行配对比较，评价龙牙百合与宝兴百合(R2X=0.766，R2Y=0.999，Q2=0.984)、龙牙百合与岷江百合(R2X=0.917，R2Y=1，Q2=0.999)、岷江百合与宝兴百合(R2X=0.901，R2Y=1.000，Q2=0.996)间黄酮类及相关化合物相对含量的差异。所有模型的Q2值均大于0.9，说明目前的PLS-DA模型具有较强的数据解释和预测能力，可用于进一步筛选差异代谢物。

2.4 3种百合属植物鳞茎甲醇提取物中黄酮类及相关化合物的差异代谢物筛选、功能注释和富集分析

2.4.1 差异代谢物筛选 结合PLS-DA分析的变量重要性投影值(VIP)和差异倍数(FC)，筛选出上述3组的差异代谢物见表3，韦恩图见图2。

表3 3种百合属植物鳞茎甲醇提取物中黄酮类及相关化合物的差异代谢物分析1)

结果显示：龙牙百合与宝兴百合鳞茎甲醇提取物的黄酮类及相关化合物间有34种差异代谢物，与龙牙百合相比，宝兴百合中18种黄酮类及相关化合物相对含量显著(P<0.05)上调，其中，差异倍数大于5的有10种，差异倍数最大的是槲皮素 3-O-葡萄糖苷(245.64)；16种黄酮类及相关化合物相对含量显著下调。龙牙百合与岷江百合鳞茎甲醇提取物的黄酮类及相关化合物间有43种差异代谢物，与龙牙百合相比，岷江百合中38种黄酮类及相关化合物相对含量显著上调，其中，差异倍数大于5的有32种，差异倍数最大的是异鼠李素 O-己糖苷(132.52)；5种黄酮类及相关化合物相对含量显著下调。与龙牙百合相比，宝兴百合和岷江百合分别有4和9种酚酸类化合物相对含量显著上调。岷江百合与宝兴百合鳞茎甲醇提取物的黄酮类及相关化合物间有39种差异代谢物，与岷江百合相比，宝兴百合中6种黄酮类及相关化合物相对含量显著上调，其中，差异倍数大于5的有2种；33种黄酮类及相关化合物相对含量显著下调。

与岷江百合和宝兴百合相比，龙牙百合中4种黄酮类及相关化合物相对含量均显著上调，分别为金圣草黄素 7-O-芸香糖苷、丁香亭 O-己糖苷、柚皮素 7-O-葡萄糖苷和野黑樱素，13种黄酮类及相关化合物相对含量均显著下调，分别为芥子酰O-己糖苷、咖啡酰莽草酸、8-甲氧基香豆圆柏素、对香豆酸、香豆素、芹菜素 7-O-芸香糖苷、芹菜素 7-O-葡萄糖苷、氧甲基金圣草黄素 O-己糖苷、C-己糖基-芹菜素 O-鼠李糖苷、槲皮素、槲皮素 3-O-葡萄糖苷、2′，6′-二羟基-4-甲氧基查尔酮-4′-O-新橘皮糖苷和圣草酚。

3组共同的差异代谢物有14种，分别为8-甲氧基香豆圆柏素、对香豆酸、香豆素、五羟黄酮 O-己糖苷、羟甲基黄酮 O-己糖苷、芹菜素 7-O-芸香糖苷、氧甲基金圣草黄素 O-己糖苷、金丝桃苷、金圣草黄素 7-O-芸香糖苷、C-己糖基-芹菜素 O-鼠李糖苷、橙皮素 C-己糖苷、异槲皮苷、槲皮素 3-O-葡萄糖苷和芦丁。

蓝色、黄色和紫色圆分别表示LY与BX、LY与MJ以及MJ与BX间的差异代谢物，重叠部分表示不同组间共同的差异代谢物Blue， yellow， and purple circles indicate differential metabolites between LY and BX， LY and MJ， and MJ and BX respectively， and overlaps indicate common differential metabolites among different groups. LY： 龙牙百合Lilium brownii var. viridulum Baker； BX： 宝兴百合L. duchartrei Franch.； MJ： 岷江百合L. regale Wilson. 数字表示差异代谢物数量The numbers indicate number of differential metabolites.

2.4.2 黄酮类及相关化合物的功能注释和富集分析KEGG聚类结果表明：与龙牙百合相比，宝兴百合和岷江百合鳞茎甲醇提取物中黄酮类及相关化合物主要富集在黄酮、黄酮醇、花青素、酚酸类和苯丙素的生物合成通路，结果见图3和图4。

2.4.2.1 与黄酮和黄酮醇生物合成有关的黄酮类及相关化合物 由图3可见：与花青素生物合成通路相比，黄酮和黄酮醇生物合成通路富集的黄酮类及相关化合物较多(37种)，其中，紫云英苷、槲皮素 3，4′-O-二-β-吡喃葡萄糖苷、槲皮苷、扁蓄苷、木犀草素 O-丙二酰己糖苷、金圣草黄素 7-O-芸香糖苷、金圣草黄素 O-己糖苷、麦黄酮 5-O-己糖苷、丁香亭 O-己糖苷、野黑樱素、芹菜素和柚皮素 7-O-葡萄糖苷12种化合物主要积累在龙牙百合中，槲皮素、木犀草素、圣草酚、柚皮素、槲皮素 3-O-葡萄糖苷、芹菜素 5-O-葡萄糖苷、芹菜素 7-O-葡萄糖苷和槲皮素 3-β-O-半乳糖苷8种化合物主要积累在宝兴百合中，芦丁等其他17种化合物主要积累在岷江百合中。岷江百合鳞茎中富集到黄酮和黄酮醇生物合成通路的15种黄酮类及相关化合物相对含量与龙牙百合相比显著上调，而宝兴百合中富集到该通路的黄酮类及相关化合物相对含量与龙牙百合相比大部分显著下调或无显著差异，而金圣草黄素 7-O-芸香糖苷的表达在宝兴百合和岷江百合中均显著下调。值得注意的是，槲皮素3，4′-O-二-β-吡喃葡萄糖苷、槲皮苷、芹菜素、金圣草黄素 O-己糖苷和麦黄酮 5-O-己糖苷虽然主要积累在龙牙百合中，但其相对含量与宝兴百合和岷江百合均无显著差异。

红色、绿色和蓝色分别示主要积累在龙牙百合、宝兴百合和岷江百合中的黄酮类及相关化合物，紫色框示KEGG未注释的黄酮类及相关化合物衍生物Red， green， and blue show the flavonoids and related compounds mainly accumulated in Lilium brownii var. viridulum Baker， L. duchartrei Franch.， and L. regale Wilson respectively， and the purple boxes show the flavonoids and related compounds derivatives unannotated by KEGG. 实线箭头表示化合物间有直接关系，虚线箭头表示化合物间有间接关系或关系未知Solid arrows indicate direct relationships between compounds， and dotted arrows indicate indirect or unknown relationships between compounds.

2.4.2.2 与花青素生物合成有关的黄酮类及相关化合物 由图3还可见：3种百合属植物中花翠素 O-己糖苷、矢车菊素 3-O-葡萄糖苷、矢车菊素 3-芸香糖苷和矢车菊素 3，5-二氧葡萄糖苷4种花青素均富

蓝色示主要积累在岷江百合中的黄酮类及相关化合物，紫色框示KEGG未注释的黄酮类及相关化合物衍生物Blue shows the flavonoids and related compounds mainly accumulated in Lilium regale Wilson， and the purple boxes show the flavonoids and related compounds derivatives unannotated by KEGG. 实线箭头表示化合物间有直接关系，虚线箭头表示化合物间有间接关系或关系未知Solid arrows indicate direct relationships between compounds， and dotted arrows indicate indirect or unknown relationships between compounds.

集到花青素生物合成通路。与龙牙百合相比，岷江百合中上述4种花青素相对含量显著上调，而宝兴百合中这4种花青素相对含量无显著差异。

2.4.2.3 与酚酸类和苯丙素生物合成有关的黄酮类及相关化合物 由图4可见：3种百合属植物鳞茎中富集到酚酸类和苯丙素生物合成通路的黄酮类及相关化合物有9种，这9种化合物主要积累在岷江百合中。与龙牙百合相比，岷江百合中除二甲基咖啡酸和阿魏酸 O-己糖苷相对含量无显著差异外，其他富集到该生物合成通路的黄酮类及相关化合物相对含量均显著上调，而宝兴百合中除咖啡酰莽草酸和香豆素相对含量显著上调外，其他黄酮类及相关化合物相对含量与龙牙百合无显著差异。

3 讨 论

本研究中，龙牙百合、岷江百合和宝兴百合鳞茎甲醇提取物均有较强的抗氧化活性，且从强到弱依次为岷江百合、龙牙百合、宝兴百合，其中，岷江百合鳞茎甲醇提取物中总酚、总黄酮和总黄烷醇含量以及DPPH·清除能力和铜离子还原能力均显著(P<0.05)高于龙牙百合和宝兴百合，与胡悦等[20]关于岷江百合抗氧化活性较强的研究结果相吻合。宝兴百合的总酚和总黄烷醇含量虽显著低于龙牙百合，但其总黄酮含量和抗氧化活性与龙牙百合无显著差异，说明岷江百合和宝兴百合虽然未被《中华人民共和国药典》收录，但其总黄酮含量和抗氧化活性较高，有较大开发潜力。相关性分析结果表明：3种百合属植物鳞茎甲醇提取物中总酚含量、总黄酮含量、总黄烷醇含量、DPPH·清除能力和铜离子还原能力间均呈极显著(P<0.01)正相关。推测黄酮类及相关化合物对3种百合属植物抗氧化活性有重要作用。

为进一步探究3种百合属植物抗氧化活性差异的原因，本研究对3种百合属植物鳞茎甲醇提取物中黄酮类及相关化合物进行了分析和比较，共检测到86种黄酮类及相关化合物。与龙牙百合相比，宝兴百合18种显著上调的差异代谢物中，差异倍数最大的是槲皮素 3-O-葡萄糖苷，其在宝兴百合中的相对含量是在龙牙百合中的245.64倍；岷江百合38种显著上调的差异代谢物中，差异倍数最大的是异鼠李素 O-己糖苷，其在岷江百合中的相对含量是龙牙百合中的132.52倍。异鼠李素衍生物具有非常高的抗氧化活性，因为其C2-C3双键决定杂环共面性，并通过电子离域在所有三环体系中参与自由基稳定，推测异鼠李素 O-己糖苷可能在岷江百合抗氧化活性中发挥了重要作用。此外，查尔酮衍生物由于B环上的羟基而具有较高的抗氧化性能[21]；与岷江百合和宝兴百合相比，龙牙百合中4种黄酮类及相关化合物相对含量显著上调，分别为金圣草黄素 7-O-芸香糖苷、丁香亭 O-己糖苷、柚皮素 7-O-葡萄糖苷和野黑樱素。

黄酮类化合物是一种生物活性化合物，天然存在于植物中，约占人体每日多酚总摄入量的2/3[22]。花青素作为重要的抗氧化物质，有助于保护植物免受氧化损伤[23]。与龙牙百合相比，岷江百合中富集到花青素生物合成通路上的4种花青素相对含量均显著上调，可能是岷江百合鳞茎甲醇提取物抗氧化活性较高的原因之一。黄酮和黄酮醇是黄酮类化合物的重要成分，具有很强的抗氧化活性。3种百合属植物富集到黄酮和黄酮醇生物合成通路上的黄酮类及相关化合物接近一半主要积累在岷江百合中，且与龙牙百合相比，岷江百合中大部分黄酮类及相关化合物相对含量显著上调，而宝兴百合富集到该通路的黄酮类及相关化合物相对含量与龙牙百合相比大部分显著下调或无显著差异，岷江百合中这些特异性上调的黄酮和黄酮醇化合物可能是其抗氧化活性显著高于龙牙百合和宝兴百合的原因。与龙牙百合相比，黄酮和黄酮醇化合物中，岷江百合中有6种槲皮素及其衍生物相对含量显著上调，而宝兴百合中分别有2和4种槲皮素及其衍生物相对含量显著上调和下调，可能是供试3种百合属植物中岷江百合鳞茎甲醇提取物的抗氧化活性最高、宝兴百合鳞茎甲醇提取物的抗氧化活性最低的原因之一。虽然富集到黄酮和黄酮醇生物合成通路上的黄酮类代谢物有12种主要积累在龙牙百合中，其中，金圣草黄素 7-O-芸香糖苷、丁香亭 O-己糖苷、柚皮素 7-O-葡萄糖苷和野黑樱素与宝兴百合和岷江百合相比均显著上调，紫云英苷和扁蓄苷与宝兴百合相比显著上调，木犀草素 O-丙二酰己糖苷与岷江百合相比显著下调，其余化合物无显著差异。Celik等[24]的研究表明：槲皮素比芦丁和柚皮苷等黄酮类化合物具有更强的抗氧化能力。苯丙素因其具有强抗氧化性和清除自由基的特性，在植物抵御生物胁迫和非生物胁迫中发挥了重要作用[25]。富集到酚酸类和苯丙素生物合成通路上的9种黄酮类及相关化合物均主要积累在岷江百合中，且除二甲基咖啡酸和阿魏酸 O-己糖苷与龙牙百合无显著差异，其他黄酮类及相关化合物相对含量均显著上调，说明岷江百合中酚酸类、苯丙素及其衍生物的存在可能是其抗氧化活性强的原因之一[26]。

4 结 论

综上所述，龙牙百合、岷江百合和宝兴百合鳞茎甲醇提取物的抗氧化活性均较强，其中，岷江百合的抗氧化活性最强。本研究首次应用UPLC-MS/MS和广泛靶向代谢组学方法，从上述3种百合属植物鳞茎甲醇提取物中共鉴定出86种黄酮类及相关化合物，包括黄酮类67种、酚酸类14种、香豆素4种和生物碱1种，其中黄酮类包括花青素4种、黄酮44种、二氢黄酮12种、黄酮醇5种和查尔酮2种。3种百合属植物的黄酮类及相关化合物差异较大，主要富集于黄酮、黄酮醇、花青素、酚酸类和苯丙素生物合成通路上。总体上看，与龙牙百合相比，岷江百合富集到花青素、黄酮和黄酮醇生物合成通路上的黄酮类及相关化合物相对含量显著上调，而在宝兴百合中其相对含量显著下调或无显著差异；9种富集到酚酸类和苯丙素化合物生物合成通路上的黄酮类及相关化合物主要积累在岷江百合中。推测酚酸类、苯丙素、花青素和异鼠李素 O-己糖苷的积累是岷江百合鳞茎甲醇提取物中总黄酮含量高且抗氧化活性强的原因，金圣草黄素 7-O-芸香糖苷、丁香亭 O-己糖苷、柚皮素 7-O-葡萄糖苷和野黑樱素的积累是龙牙百合抗氧化活性较强的原因。综合上述分析认为，岷江百合具有较大的开发利用潜力。