T2值定量评估不同肝纤维化分期大鼠肝脏铁沉积

金明丽，潘志华，蒋 颖，赵 琪

(成都医学院第二附属医院 核工业四一六医院放射科，四川 成都 610031)

肝纤维化是慢性肝脏疾病进展为不可逆性肝硬化、肝功能衰竭甚至肝细胞癌的必经病理阶段[1],常伴不同程度铁沉积而加速病情进展。肝脏穿刺活检是评估肝脏铁含量的金标准，但存在取样误差及感染等风险；血清铁、铁蛋白等可在一定程度上反映铁沉积，但无法直接定量肝脏铁含量，且受全身代谢状况影响[2]。MR T2 mapping是评估铁含量的无创性方法之一，其参数T2弛豫时间(T2值)及T2弛豫率(R2值)广泛用于定量评估脑、脾、肝及心脏铁含量[3]。本研究观察T2值评估不同纤维化分期大鼠肝脏铁沉积的价值。

1 材料与方法

1.1 建立大鼠肝纤维化模型 60只2～3月龄SPF级SD雄性大鼠，体质量(202.0±3.2)g，购自西南医科大学动物实验中心[生产许可证SCXK(川)2013-17，使用许可证为SCXK(川)2013-181]，常规饲养。分别于其腹腔及后腿内侧皮下注射浓度40%的四氯化碳食用调和油悬浊液0.3 ml/100 g体质量，每周每处注射2次，共注射12周，建立大鼠肝纤维化模型。本研究经院实验动物伦理委员会批准。

1.2 仪器与方法 采用Philips MR Achieva 3.0T超导MR仪，配备16通道腕关节线圈。于造模第5～12周，每周选取1～6只体质量偏轻、毛色较枯黄、精神萎靡的大鼠行上腹部扫描。于后腿内侧皮下注射2%戊巴比妥钠0.2 ml/100 g体质量麻醉大鼠，自膈顶至双肾下缘水平进行T2 mapping扫描，采用多回波梯度-自旋回波(multi-echo gradient and spin echo, M-GRASE)序列，回波数4，TE117 ms，TE234 ms，TE351 ms，TE468 ms，TR 1 552 ms，层厚2.5 mm，层间距1 mm，矩阵240×240。

将图像传导至Philips后处理工作站(Extended MR WorkSpace 2.6.3.4)，系统自动重建T2 mapping图像。由2名具有5年MR诊断经验的医师于原始图像(TE为17 ms，图1A)显示肝脏较大层面避开伪影、胆管、大血管、局灶性肝脏损伤部位等放置3个面积10 mm2的圆形ROI[4]，并将ROI复制到T2 mapping中的相同区域(图1B)，测量其T2值；以2名医师对3个ROI的测量结果的均值为最终结果。

1.3 病理检查 扫描结束后处死大鼠，取肝脏组织送病理科行Masson、普鲁士蓝及HE染色。由2名具有8年病理诊断经验的主治医师采用双盲法评估肝纤维化S分期、铁质及脂肪病理分级。肝脏纤维化分期标准：S0期无纤维化；S1期汇管区扩大、纤维化；S2期汇管区周围纤维化，纤维间隔形成，小叶结构存在；S3期纤维间隔伴小叶结构紊乱，无肝硬化；S4期即早期肝硬化。肝脏脂肪分级标准：0级<5%肝细胞受累；1级5%～33%肝细胞受累；2级34%～66%肝细胞受累；3级>66%肝细胞受累。肝脏铁质分级标准：0级无铁颗粒；1级仅极少数肝细胞中可见铁颗粒；2级指5%～10%肝细胞中可见铁颗粒；3级为≥40%肝细胞可见铁颗粒；4级为大多数肝细胞中见丰富铁颗粒[5-7]。意见不一致时，提请上级医师复核并裁定。

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0统计分析软件。计量资料不符合正态分布，以中位数(上下四分位数)表示，采用Kruskal-WallisH检验进行比较，两两比较采用Nemenyi法。采用Spearman相关分析观察大鼠铁质病理分级与T2值的相关性，以Kendall相关系数(tau-b)分析肝脏铁质病理分级与纤维化S分期间的相关性。绘制T2值诊断肝脏铁质病理分级的受试者工作特征(receiver operating characteristic， ROC)曲线，计算曲线下面积(area under the curve, AUC)。采用双因素方差分析评估脂肪、铁质病理分级、肝纤维化分期对T2值的影响。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理结果 实验过程中20只大鼠死亡，共40只大鼠纳入研究；其中肝脏纤维化S0期6只、S1期6只、S2期8只、S3期10只、S4期10只(图2)，铁质病理分级0级7只、 1级9只、2级12只、3级10只、4级2只(图3)，脂肪病理分级0级5只、1级8只、2级12只、3级15只。因铁质病理分级4级样本量较少，将3级与4级合并进行统计学分析。

2.2 相关性分析 肝纤维化分期与肝脏铁质病理分级呈正相关(tau-b=0.851，P<0.001)，铁质病理分级与T2值呈负相关(rs=-0.803，P<0.001)。

2.3 不同铁质病理分级T2值比较 铁质病理分级0级大鼠肝脏T2值为59.10(60.70,57.80)ms,1级为56.50(57.25,52.05)ms，2级为53.95(56.02, 49.75)ms，≥3级为45.85(48.88,34.93)ms，总体差异有统计学意义(H=26.367，P<0.001)；两两比较,铁质病理0级与1级、1级与2级肝脏T2值差异均无统计学意义(P均>0.05)，其余各铁质病理分级间T2值差异均有统计学意义(P均<0.05)。

2.4 ROC曲线分析 T2值鉴别肝纤维化分期大鼠肝脏有无铁沉积及铁质病理分级≥3级的AUC分别为0.97、0.94，见表1。

表1 T2值诊断肝纤维化大鼠铁质病理分级的效能(n=40)

2.5 双因素方差分析 对肝脏T2值行正态转换，进一步双因素方差分析结果显示，不同脂肪病理分级肝脏T2值差异无统计学意义(F=0.37，P>0.05)，而不同铁质病理分级间肝脏T2值差异有统计学意义(F=5.10，P<0.05)，不同肝纤维化分期肝脏T2值差异无统计学意义(F=0.14，P>0.05)；三者交互作用对肝脏T2值无明显影响(F=1.43，P>0.05)。

3 讨论

肝纤维化常见于病毒性肝炎、酒精性及非酒精性肝病、血色素沉着症等急、慢性肝损伤，常伴不同程度铁和脂肪沉积，加速芬顿反应，产生活性氧，严重破坏细胞和组织，导致肝纤维化进展为肝硬化，发生门静脉高压等并发症，甚至肝细胞癌。准确评估铁沉积对治疗肝纤维化及评估预后十分重要[8]。既往研究[9]显示，以四氯化碳灌胃建立肝纤维化小鼠模型过程中，随造模时间延长，小鼠肝纤维化程度逐渐增加，并存在不同程度脂肪及铁沉积，且铁沉积随纤维化程度加重而增加。江远等[10]发现正常大鼠存在轻度肝铁沉积；随着肝纤维化加重，肝脏库普弗细胞及活化肝星状细胞铁沉积增多，且存在不同程度脂肪沉积及炎症细胞浸润。本研究结果与上述研究相符。

MRI是量化肝铁沉积的无创性检查方法，有助于指导临床治疗肝纤维化。铁为超顺磁性物质，影响组织的易感性，使B0场不均匀，增加蛋白质结合水的磁化率，致组织T2和T2*弛豫时间缩短，组织信号强度减低， R2及R2*值增加。T2 mapping对静磁场不均匀较不敏感，图像信噪比高于T2*mapping。目前常用组织T2及R2值评估肝脏铁含量。既往研究[11-12]证实，组织R2与肝脏铁含量呈显著相关；肝铁正常及铁过载患者中，R2值与肝脏穿刺活检铁含量呈线性相关(r=0.89)[13-14]，提示其诊断铁过载的效能相近，且R2值评估肝脏铁沉积的重复性及准确性较好。KRISTANEEPAILBOON等[15]应用1.5T及3.0T MR仪测量20名健康者及42例肝铁沉积患者的T2及T2*值，发现肝脏T2值(3.0T)及T2*值(1.5T)均能较好评估肝脏铁质病理分级，提示其可作为穿刺活检的替代方法。FRANCA等[16]应用3.0T MR多回波化学位移编码序列图像研究101例弥漫性肝病患者，发现肝脏R2*值随铁质病理分级增高而增加,其鉴别0级与1～4级铁质病理分级的AUC为0.848[95%CI(0.776,0.919)]，鉴别0～2级与3～4级铁质病理分级的AUC为0.976[(95%CI(0.949,1.000)]，且R2*值评估铁含量不受肝纤维化及脂肪沉积的影响。

本研究结果证实T2值与肝脏铁质病理分级呈负相关，T2值可用于评估肝纤维化大鼠肝脏铁沉积，且不受肝脂肪病理分级、纤维化分期的影响，其鉴别肝纤维化大鼠肝脏有无铁沉积、肝脏铁质病理分级≥3级的效能较好；0级与1级、1级与2级铁质病理分级大鼠肝脏T2值差异无统计学意义，分析可能原因，T2值通过弛豫时间反映组织内铁含量变化，而肝脏弛豫时间受铁浓度、铁颗粒分布及大小的影响，肝纤维化及脂肪沉积均可导致肝脏弛豫时间增加[17-18]，部分抵消铁沉积T2弛豫时间的减少，且肝脏炎症和纤维化会限制水分子扩散运动，降低T2值对铁的敏感性。本研究早期肝纤维化大鼠铁沉积较少且不均匀，存在严重脂肪沉积，导致0级与1级、1级与2级铁质病理分级T2值差异无统计学意义；随纤维化进展，肝脏细胞水肿及脂肪变性减轻，肝脏铁沉积增加，S3、S4期肝细胞铁沉积明显，肝脏T2弛豫时间明显缩短。

综上，T2值对定量评估肝纤维化大鼠模型肝脏铁沉积具有一定价值，有助于鉴别有无铁沉积及病理分级≥3级铁沉积。但本研究样本量小，且未能定量检测大鼠肝脏铁质及脂肪含量，有待进一步完善。