表观遗传调控与作物育种

宋显伟， 唐善杰， 曹晓风

（中国科学院遗传与发育生物学研究所，北京 100101）

表观遗传学是指不涉及DNA序列的改变、但可以通过有丝分裂和减数分裂进行遗传的生物现象，包括DNA甲基化（DNA methylation）、组蛋白修 饰（histone modification）、RNA 修 饰（RNA modification）、染色质重塑（chromatin remodeling）以及非编码RNA（non-coding RNA）等。表观遗传主要在转录和转录后水平调控基因表达及转座子活性，在生物生长发育、逆境胁迫及基因组稳定性等方面发挥重要作用。

转座子等重复序列是表观遗传调控的重要对象。转座子是基因组中活跃的DNA分子，其通过不同的转座机制能够从基因组中一个位点整合到新位点，对动、植物基因组组成、进化和基因表达调控具有重要作用。通常情况下，转座子被多种表观遗传修饰所沉默进而维持基因组稳定性。相比于模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana），作物基因组通常含有大量转座子。例如玉米和大麦基因组序列含有85%左右的转座子；在水稻基因组中，尽管转座子含量为40%左右，但大量转座子散布在基因周围，可作为表观元件精细调控基因表达，进而控制重要农艺性状[1-2]。作物中大多数表观遗传因子的功能丧失会造成严重的发育缺陷甚至致死，表明表观遗传调控对于作物生长发育至关重要。

表观遗传修饰能迅速响应环境做出改变，因此表观遗传变异在生物进化过程中非常普遍，变异频率远高于遗传变异，拟南芥中DNA甲基化的天然突变率约为碱基突变的1万倍[3]。一些表观遗传修饰在植物生殖细胞的配子发育过程中能忠实遗传，例如对基因表达起重要调控作用的CG位点DNA甲基化，在配子发育及受精后并不像动物那样经历擦除及重建过程[4]，研究表明，经历10代高盐胁迫的拟南芥较正常生长条件下积累了多达45%的CG位点甲基化变异，而75%的变异可传递给下一代[5]。表观变异的高频发性及稳定跨代遗传性为作物育种和性状改良提供了新的变异源泉。

1 表观遗传调控重要农艺性状

1.1 DNA甲基化调控

近年来随着表观遗传学的深入研究，发现越来越多的重要农艺性状受表观遗传调控，尤以DNA甲基化研究最多。DNA甲基化（5-甲基胞嘧啶，5mC）是进化上保守的一种重要表观遗传修饰，在植物中可发生在CG、CHG和CHH (H代表A、T或C)位点，主要在转录水平抑制基因的表达和转座子的活性，其功能对植物生长发育是必需的，例如维持CG位点甲基化的DNA甲基转移酶OsMet1-2功能丧失导致水稻早期致死[6]。

在已有研究中，由转座子引发的DNA甲基化变异介导重要农艺性状形成的例子最为常见[7]。例如甜瓜的性别决定即是由插入到关键性别决定基因CmWIP1启动子区转座子的表观遗传状态改变所介导的[8]；番茄果实的维生素E含量会受其合成关键基因VTE3(1)启动子区域SINE逆转录转座子DNA甲基化影响，不同程度甲基化介导VTE3(1)表达量不同，从而产生维生素E含量不同的番茄[9]。油棕体细胞繁殖过程高诱发的“mantled”变体现象也是由转座子介导表观变异引起的，组织培养引发插入到关键持家基因DEFICIENT的karma反转座子DNA甲基化丢失，使得该基因拼接异常形成“mantled”变体，严重影响棕榈果实产量[10]。Yang等[11]和 Huang等[12]发现，CACTA 及Harbinger-like类转座子插入到光周期敏感基因ZmCCT启动子区域，增加了此区域DNA甲基化水平并降低了ZmCCT基因表达，减弱了玉米对光周期的敏感性，促进了玉米在温带长日照条件下的适时开花。

由于转座子特别是一些MITE类DNA转座子大量分布在基因周围，可作为表观元件精细调控基因表达，进而控制重要性状。Zhang等[13]发现，水稻BR合成的关键基因RAV6启动子区MITE转座子的DNA甲基化丢失，可导致该基因异位表达而产生大的叶夹角。Deng等[14]发现，PigmS基因上游MITE转座子产生siRNA，通过介导DNA甲基化抑制PigmS在叶中表达，进而释放其拮抗的PigmR进行广谱抗稻瘟病。最近在无毛非洲栽培稻(Oryza glaberrima)中发现，有利于收获和储藏的颖壳无毛性状是hAT转座子插入到控制毛状体发育基因GLAG5（GLABROUS GLUME 5)上，引发DNA甲基化，抑制了该基因表达而产生无毛的有利性状[15]。

在非转座子介导DNA甲基化变异方面，Zhang等[16]发现，控制水稻理想株型的Ideal plant architecture1(IPA1)上游的结构变异会抑制启动子区DNA甲基化，使得IPA1适量表达，产生理想株型；水稻PRC2复合体重要成员FIE1的编码基因5’上游区域发生DNA甲基化丢失，可导致FIE1异位表达，产生矮化等表型[17]。在调控水稻穗长方面，Luan等[18]发现一段长非编码RNA转录终止位点的DNA甲基化丢失，导致穗长严重变短，表明该位点的甲基化修饰调控了水稻穗长发育。

综上所述，目前已获得一些决定重要农艺性状的DNA甲基化变异，为作物重要性状改良和利用提供了表观遗传资源。但是作物中的重要表观变异仍未被大规模鉴定。此外，这些表观变异主要由自然演化产生，还缺乏人工创制的大量作物表观变异资源。

1.2 非编码RNA调控

作为表观遗传调控的重要组成部分，非编码RNA，特别是小分子RNA也被发现调控了众多重要性状[19]。小分子RNA为一类长度为20～30 nt的非编码RNA，在植物中主要分为miRNA和siRNA两类，它们被加工成熟后，与进化保守的AGO蛋白形成沉默复合体，从而以碱基互补配对的形式靶向被调控靶基因的mRNA，通过介导DNA甲基化、剪切、翻译抑制等方式在转录和转录后水平负调控靶基因的表达，参与几乎各种生物学过程。

miRNA是一类进化上保守的小分子RNA，调控很多重要转录因子，在植物生长发育和逆境胁迫中发挥重要调控作用[20]。已有研究表明，适当减弱或增强小分子RNA与其靶基因的负调控作用，会产生优异农艺性状，为作物遗传改良提供了一个新途径。例如，控制水稻理想株型的OsSPL14基因受miR156负调控，其靶向位点1个碱基变异使得miR156调控作用减弱，OsSPL14适量增加表达，产生理想株型及高抗病表型[21-22]；由自然变异或人为操纵引发的miR396对靶基因GRF4的负调控减弱，可促使水稻籽粒变长、穗子变大、产量提高[23-26]。同样，过表达水稻miR397从而增强其对编码木质素生物合成关键酶-漆酶LAC基因负调控，也可显著提高穗粒数和种子大小[27]。但过表达梨miR397则降低了梨果实的木质素含量和石细胞数量，提高了梨的适口性[28]。抑制水稻miR147、miR1432或过表达miR408可显著提高籽粒大小[29-30]。同样在大麦中，适当抑制miR172的调控可提高麦粒密度[31]。除了产量及品质性状外，miRNA也在植物与环境互作方面发挥重要调控作用，包括植物可塑性、豆科植物结瘤固氮、生物及非生物胁迫等过程[20]。

siRNA是高等植物中大量存在的一类小RNA分子，包括与异染色质相关的hc-siRNAs及次级tasiRNAs和phasiRNAs等。不同的siRNA也调控了一些重要农艺性状。单子叶植物保守的生殖细胞大量表达phasiRNAs被发现调玉米和水稻环境依赖的育性[32-35]，其中一些已被应用于生产实践。例如，在两系杂交稻生产中，首个发现的两用光敏不育系农垦58S及其衍生的温敏不育系‘培矮64S’，其环境依赖育性被发现为phasiRNAs位点自然变异所介导[36-38]。最近研究发现，受低温诱导表达的AGO1d介导产生的phasiRNAs调控了水稻低温雄性不育，ago1d突变体表现为低温雄性不育，具有发展为温敏不育系的潜力[39]。此外，由MITEs产生的siRNA也被发现参与玉米抗旱和水稻抗病调控[40-41]。

除了DNA甲基化和小RNA外，最近的研究也发现，RNA m6A修饰在调控作物重要农艺性状上发挥重要功能。在水稻和马铃薯中通过外源导入RNA m6A去甲基化酶FTO，一定程度上降低全基因组m6A甲基化水平，可显著提高光合效率及抗旱能力，增加田间作物产量约50%，同时并未降低品质[42]。鉴于m6A修饰的保守性，该工作为作物育种开辟了新的技术手段和研究方向。

挖掘和克隆作物重要农艺性状相关的非编码RNA，阐明它们在作物性状决定中所起的调控作用，可为高产高抗作物新品种的培育提供新的研究思路和研究手段。另外，外源小RNA介导的RNA干扰技术已成为人为调控基因表达的新手段，在提高作物抗病和抗虫能力方面有着良好的应用前景。

2 表观遗传与倍性育种

倍性育种是指改变作物染色体组的数量进行育种的方法，根据其对于染色体组减半或加倍可分为单倍体育种和多倍体育种。单倍体（haploid）个体基因组来源于遗传重组后减数分裂产生的单方配子。单倍体经简单加倍后可获得纯合稳定的双单倍体（doubled haploid，DH），省去了传统杂交育种中连续多代自交过程，极大地加快了育种进程。单倍体育种技术在玉米育种过程中已经得到广泛应用，但是其他作物中由于缺少成熟高效的单倍体诱导系，制约了单倍体育种技术的发展。Ravi等[43]在拟南芥中研究发现，组蛋白H3变体着丝粒组蛋白H3(CenH3)功能弱化突变体与野生型杂交可以诱导基因组减半。随后，Kelliher等[44]将玉米CenH3基因敲降也获得了单倍体诱导系，但是由于其诱导效率极低并不适合生产应用。最近，Lv等[45]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除了小麦CenH3基因，获得了最高可达8%的单倍体诱导率，进一步研究发现CenH3杂合编辑类型的诱导率要高于纯和编辑株系。由于CenH3功能高度保守，因此基于CenH3的单倍体诱导技术具有非常广阔的应用前景。

多倍化事件是推动生物进化的重要驱动力之一,研究显示,几乎所有开花植物都经历了至少1次基因组加倍事件,主要多倍体作物包括小麦、棉花、油菜、马铃薯、甘蔗等[46]。多倍体作物在长期驯化过程中表现出强烈的适应性优势,具有生物量大、抗逆性强、水肥利用效率高等特征[47]。物种多倍化过程中除了大量基因丢失或加倍之外还表现出亚基因组不对称性,表现为有偏向性地表达其中一个基因组上的基因[48]。组蛋白修饰、转座子和染色质开放性可能是造成这种不对称性的重要原因。Han等[49]以异源四倍体棉花及其祖先种为研究对象，深入研究了棉花进化过程中染色质开放状态的动态变化，发现组蛋白修饰、转座子和顺式调控元件之间的协同互作推动了多倍化后的染色质动态变化。Yuan等[50]发现，六倍体小麦多倍化过程中，开放元件远距离互作调控差异可能是造成亚基因组间基因表达偏好性的分子基础。也有研究指出转座元件上的DNA甲基化修饰和24nt siRNA指导的DNA甲基化参与调控异源多倍体亚基因组的不对称性[51-53]。尽管多倍体作物的研究存在基因组庞大、性状解析困难等难题，但是随着基因组学、表观组学和群体遗传学的飞速发展，将促进多倍体作物起源和人工驯化过程中重要农艺性状的形成机制解析及优异基因资源的挖掘和利用。

3 表观遗传育种技术

CRISPR/Cas9基因组编辑系统以精确性和易用性逐渐替代了传统的锌指核酸酶 (zinc finger nuclease, ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALEN)技术，在作物改良上具有巨大应用前景，也越来越受到育种家重视[54]。除序列编辑外，CRISPR/Cas9系统也可改造用于靶向表观编辑。将Cas9蛋白的双链DNA切割位点突变为无切割活性的dCas9蛋白，仅利用其在guide RNA引导下结合基因组的功能，将表观修饰酶靶向基因组特定位点实现定点表观编辑[55]。Gallego-Bartolomé等[56]在拟南芥中利用SunTag-TET1系统实现了FWA位点靶向DNA甲基化去除，产生晚花表型。Papikian等[57]将去甲基化酶TET1替换为烟草甲基化酶DRM催化结构域，实现了靶向DNA甲基化修饰。Tang等[58]首次在作物中建立了靶向DNA甲基化去除编辑体系，靶向去除了FIE1基因近启动子区域的DNA甲基化，产生了一系列的植株矮化表型。更为重要的是，编辑产生的低甲基化状态和矮化性状可以在分离出转基因载体的后代中稳定遗传。

此外，基于DNA甲基化等表观变异可在植物世代交替过程稳定遗传的特性，人为创造全基因范围表观遗传变异，利用遗传重组实现表观变异位点分离，创建的表观遗传重组自交系（epi-RILs）已在模式植物拟南芥中被成功构建[59-60]。利用DNA甲基化转移酶MET1和染色质重塑因子DDM1功能缺失突变体，建立全基因组DNA甲基化缺失，通过与野生型杂交、分离及传代进行epi-RILs构建。该群体不仅包含大量表观变异，而且激活大量转座子跳跃，介导了遗传变异，产生了丰富的表型变异，其中包括耐盐、抗病等优异性状。

表观编辑技术及表观重组自交系为人工创制表观变异资源提供了有效工具。但在作物中，相关研究还较少。更多类型适用于作物的表观修饰编辑器亟待开发，作物表观重组自交系同样亟待创建。

4 结语

综上所述，表观遗传已被证实在调控作物重要农艺性状上发挥重要作用，特别是对作物性状精细调控上，表观遗传往往优势更强于遗传调控。表观遗传较高的自然突变频率引发的表观变异及其介导的遗传变异，极大丰富了作物表型多样性，其中不乏优良性状，加之DNA甲基化等表观遗传修饰可在世代间稳定遗传，促使表观遗传变异成为优良农艺性状获取的新型变异源泉。但是目前作物中表观遗传研究还相对有限，需加强并深入解析表观遗传在农艺性状形成中的调控作用。因此，通过表观遗传编辑技术等手段创制能够有效改良重要农艺性状的表观变异，培育高产优质多抗的农作物品种，对于促进粮食增产稳产具有重要的应用价值和战略意义。