一株反硝化聚磷菌的筛选鉴定及脱氮除磷性能研究

罗 俊，孙 霞,2，刘 扬，张 虎

(1.湖南百舸水利建设股份有限公司, 湖南 长沙 410007;2.山东江河湿地生态研究院, 山东 济南 271100;3.中国水利水电科学研究院, 北京100080)

0 引言

洞庭湖是我国第二大淡水湖，由于工农业废水污染、航运、水产养殖等因素，其富营养化问题日渐凸显。《2018年中国生态环境状况公报》发布的淡水环境状况表明，洞庭湖为中度营养化状态，水质为Ⅳ类，主要污染指标为总氮、总磷。黄代中等[1]近20年的研究发现，洞庭湖区的营养化状况呈恶化趋势，特别是东洞庭湖，已由中营养化过渡为轻度富营养化。因此改善洞庭湖区水质和富营养化状况，加快水体脱氮除磷研究尤为迫切。

利用生物法同步去除氮磷被认为是最经济有效的方式，但是在传统的生物脱氮除磷过程中存在硝化菌和聚磷菌菌龄不同，碳源需求竞争等诸多矛盾。20世纪80年代，Osborn以及Bortone等相继发现某些反硝化菌在硝酸盐存在情况下具有吸磷功能[2-3]，后来，研究者陆续发现某些聚磷菌可以利用亚硝酸盐为最终电子受体进行吸磷，随后一些兼具脱氮和除磷特性的反硝化聚磷菌被分离出来，使得脱氮除磷同步进行成为可能。已报道的反硝化聚磷菌有不动杆菌属 (Acinetobacter)、假单胞菌属 (Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、 气单胞菌属(Aeromonas)、 副球菌属 (Paracoccus)、 寡营养单胞菌属(Stenotrophomonas)、莫拉氏菌属 (Moraxella) 和肠杆菌属 (Enterobacter) 等[4-6]。

本研究从洞庭湖底泥中分离筛选出1株高效反硝化聚磷菌，并考察了菌株对人工合成模拟湖水的脱氮除磷效果，以期为反硝化聚磷菌处理富营养化水体提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株来源

试验样品于2018年7月采自洞庭湖底泥，样品低温保存，及时带回实验室分离菌株。

1.1.2 培养基

富集培养基(g/L)：CH3COONa·3H2O 3.32，KH2PO40.04; NH4Cl 0.305，KNO30.3，MgSO4·7H2O 0.091，CaCl2·2H2O 0.026，NaCl 0.02，微量元素2mL，pH 7.2，用于反硝化聚磷菌的富集培养。

BTB培养基(g/L)：C4H4Na2O48.5，KNO31.0，KH2PO41.0，FeCl3·6H2O 0.5，MgSO4·7H2,1.0，CaCl2·7H2O 0.2，BTB(1%溶于酒精)1mL，pH 7.2，用于反硝化聚磷菌的初筛。

牛肉膏蛋白胨培养基(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，琼脂18-20，NaCl 5，pH 7.2，用于菌株的形态观察、保存。

缺磷培养基 (g/L)：CH3COONa·3H2O 3.32，Na2HPO4·2H2O 0.023，MgSO4·7H2O 0.081，K2SO40.018，NH4Cl 0.153，CaCl2·2H2O 0.011，微量元素2mL，pH 7.2。

富磷培养基(g/L)：CH3COONa·3H2O 3.32，KH2PO40.04，MgSO4·7H2O 0.091，CaCl2·2H2O 0.026，NH4Cl 0.305，微量元素2mL，pH 7.2。

富氮富磷培养基(g/L)：CH3COONa·3H2O 3.32，KH2PO40.035，NH4Cl 0.305，KNO30.3，MgSO4·7H2O 0.091，CaCl2·2H2O 0.026，NaCl 0.02，微量元素2mL，pH 7.2。

微量元素溶液：Na2EDTA 63.7mg/L，MnCl2·4H2O 5.06mg/L，ZnSO42.2mg/L，FeSO4·7H2O 5.0mg/L，CaCl25.5mg/L，CuSO4·5H2O 1.57mg/L，Na2MoO4·4H2O 1.1mg/L，CoCl2·6H2O 1.61mg/L，pH 7.0。

1.1.3 人工合成模拟污水(g/L)

CH3COONa·3H2O 3.32，KH2PO40.035，NH4Cl 0.305，KNO30.3，MgSO4·7H2,0.091，CaCl20.02，NaCl 0.02，微量元素溶液 2mL。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株富集与分离

取10g泥样接入90mL无菌水中，120r/min振荡1h，静置20min，取上清液2mL接种于100mL富集培养基中，28℃，120r/min振荡培养24h，使微生物快速生长，达到富集的目的。如此重复接种培养3次后，将富集菌液梯度稀释，取100μL稀释液涂布于BTB平板，28℃培养2～3d，挑选周围培养基出现蓝色菌落，并用划线法分离纯化获得单菌落。

1.2.2 菌株的初筛与复筛

将上述分离出的单菌落，接种于缺磷培养液中，28℃ 培养24h后，在转速为10000rpm 的离心机中离心2min，取其上清液，用灭菌水洗涤，重复3次，将菌体细胞重悬于富磷培养基中，在恒温 28℃的摇床上培养 24h，然后对培养液离心，取其上清液，测定分析接种前后TP浓度的变化，对除磷率高于 50% 的菌株接种于富氮富磷培养基中，28℃，120r/min摇床培养24h后，对TP和TN的含量进行测定，既能够脱氮又能够除磷的菌株即为本实验的目标菌株。

1.2.3 菌株鉴定

经革兰氏染色显微观察其形态，再结合其生理生化和菌落特征进行初步鉴定，然后委托北京诺赛基因组研究中心对16S rRNA的PCR扩增产物进行序列测定，应用BLAST软件将所得序列与GenBank中的序列进行同源性分析。

1.2.4 生长曲线测定

菌株的生长情况采用比浊法测定，利用分光光度计以OD600表示。在30℃，pH7.2，120r/min培养条件下，每2h取样测定一次。

1.2.5 DT4-2菌株对模拟污水的净化

将复筛效果较好的DT4-2菌株接种至牛肉膏蛋白胨培养液中，28℃，120r/min振荡培养12h，取3mL菌液离心弃上清，沉淀用无菌水清洗2次，重悬至模拟污水反应体系中，用250mL三角瓶作为反应器，28℃，120r/min振荡培养，定时取培养液，10000rpm离心，测定上清液总磷、总氮含量。

1.2.6 外界因素对净化效果的影响

改变外界环境因素，如温度、接种量、作用时间等，按照1.2.5方法测定不同条件下模拟污水中接种前后氮、磷含量变化，计算分析其对TN、TP的去除效率。

1.2.7 测定方法

总氮采用碱性过硫酸钾分光光度法测定，总磷采用钼锑抗分光光度法测定，具体操作步骤参照《水和废水监测分析方法》(第四版)[5]。

2 结果与分析

2.1 菌株的鉴定

通过富集培养、初筛复筛等方法，筛选获得菌株DT4-2的脱氮除磷效果优于其他菌株，因而选择DT4-2作为后续实验菌株。经过形态观察发现，DT4-2为革兰氏阴性菌，半固体培养基穿刺实验表明无鞭毛，不能游动。菌落呈圆形，光滑湿润，近白色，不透明 (图1)。将菌株DT4-2的16s rRNA序列与GenBank数据库中的基因序列BLAST比对，结果显示DT4-2与Gemmobacter lanyuensis的相似性达99%，因此初步鉴定菌株DT4-2为Gemmobacter lanyuensis。

图1 菌株DT4-2的菌落

2.2 菌株DT4-2的生长曲线

对筛选得到的DT4-2菌株进行生长曲线测定，得到典型的“S型曲线”(图2)。从图2可以看出，菌株DT4-2的延滞期不足2h，说明该菌株能很快适应新环境，3h以后进入对数生长期，12h后菌株进入稳定期，OD600值稳定在1.8左右，24h后出现衰退趋势。说明菌株DT4-2易于培养，稳定期持续时间较长，具有潜在应用价值。因此后续净水实验中确定该菌株的活化培养时间为12h，此时菌株的生长速率最大，生物活性最高。

2.3 不同接种量菌体在模拟水中的生长状况

为确定获得最佳净水效果的接种量，将DT4-2按不同接种量接种于人工模拟水中，其生长情况见图3。除接种量为0的体系中OD600值始终保持为0外，不同接种量下培养体系的OD600值均随着培养时间的延长而上升。在三个研究时间点中，以2%的接种量菌株的生长最佳，各接种量下菌株的生长表现为OD600-2%>OD600-10%>OD600-4%≈OD600-8%>OD600-6%，因此后续实验使用2%的接种量。

图2 菌株DT4-2的生长曲线

图3 不同接种量-培养时间下菌株DT4-2的生长情况

图4 菌株DT4-2在不同作用时间下的脱氮除磷效果 图5 菌株DT4-2在不同温度下的脱氮除磷效果

2.4 作用时间对净水效果的影响

以2%的接种量接种于人工模拟水中，考察获得最佳脱氮除磷效果的作用时间，结果如图4所示。从图4可以看出，在模拟水反应体系中，DT4-2菌株对氮和磷的去除时间相差较大。菌株在模拟水反应体系中作用3h后就有快速除磷的效果，作用8h对磷的去除率达到96.7%。而对氮的去除所需时间较长，作用6h后才显示对氮的快速降解，24h后达到平稳上升的阶段，作用60h，最大除氮率达到83.3%。

2.5 温度对净水效果的影响

温度对该菌株脱氮除磷效果的影响如图5所示，当温度为25℃时，菌株对磷的去除达到最大值，去除率为92.9%；当温度30℃时，脱氮效果较好，对氮的去除率为67.8%；当温度超过30℃，脱氮除磷的效果逐渐减弱，因此该菌株对污水脱氮除磷的最适温度为25～30℃。

3 结论

(1)通过富集培养、BTB平板涂布筛选、平板划线纯化等方法，从洞庭湖水体和底泥中分离菌株，经复筛得到1株脱氮除磷效果较好的菌株DT4-2。

(2)结合形态特征和16s rRNA基因序列分析，确定菌株DT4-2为 芽殖杆菌属中的Gemmobacterlanyuensis。本研究筛选获得的芽殖杆菌属在反硝化聚磷菌的研究报道中较少见。

(3)人工合成富营养化水体的净化实验表明，初始接种量为2%时，菌体生长状况最好，在反应体系中作用8h除磷率可达96.7%，作用60h，除氮率可达到83.3%。该菌株适合的脱氮除磷温度为25～30℃。