思茅松毛虫成虫肠道细菌多样性

李选文，熊 智，王金华，周艺萍，熊忠平

（1.西南林业大学生命科学学院，昆明 650224；2.西南林业大学继续教育学院，昆明 650224；3.西南林业大学生物多样性学院，昆明 650224）

0 引言

【研究意义】思茅松毛虫（Dendrolimu kikuchii）隶 属 于 鳞 翅 目（Lepidoptera）枯 叶 蛾 科（Lasiocampidae）松毛虫属（Dendrolimus）[1]，主要分布在我国云南、四川、湖南、湖北、贵州等省[2]。思茅松毛虫一年发生1～2代，幼虫共有7个龄期，以3龄越冬，在云南主要危害云南松（P.yunnanensis）、思茅松（Pinus kesiya var.langbianensis）、油杉（Keteleeria cyclolepis）等松科植物，是我国危害最为严重的6种松毛虫之一[3-4]。在安徽石台县当思茅松毛虫大面积爆发的时候，最高虫口密度可达700条/株，虫株率可达90%以上[5]；而在云南景东，每5～8年就会爆发一次大规模的思茅松毛虫虫害[6]。思茅松毛虫成熟后，雌蛾多产卵于松针上，成块状，每一只雌蛾产卵200～800粒，一般300～500粒，产卵量最高可达1 700粒。肠道内的微生物可以为寄主提供营养、协助寄主消化食物、抵抗病原物、增强寄主免疫力等，而寄主则为肠道微生物提供一个生存场所，二者相互依存、互利共生[7-8]。随着大量菊酯类等化学药品的使用，在思茅松毛虫体内也会产生抗药性[9]。【前人研究进展】昆虫肠道结构、环境因素、食物等都影响昆虫肠道微生物多样性[10-11]。昆虫肠道一般分前、中、后肠三部分[12]肠道的复杂结构、不同的肠道部位微环境不同，进而影响微生物多样性[13]。骆米娟等[14]采用传统的微生物培养方法研究南亚实蝇[Bactrocera tau（Walker）]成虫肠道可培养细菌，发现肠杆菌属（Enterobacter）是南亚雌成虫肠道细菌的优势菌群，Uncultured bacterium/bacterium是南亚雄成虫肠道可培养细菌的优势菌群。杨晓晴等[15]采用高通量测序研究灰飞虱（Laodelphax striatellus）成虫肠道细菌的多样性，发现灰飞虱雌、雄成虫体内优势菌为醋酸杆菌科未分类属（Unclassified Acetobacteraceae），雌成虫体内沃尔巴克氏体属（Wolbachia）的丰度分别为13.81%，雄成虫体内沃尔巴克氏体属（Wolbachia）的丰度分别为44.52%，沃尔巴克氏体属有杀雄、孤雌生殖等现象。王蕊蕊等[16]采用传统的微生物培养方法研究了桉树枝瘿姬小蜂（Leptocybe invasaFisher&La Salle）雌成虫肠道可培养细菌的多样性，共分离得到11株细菌，其中厚壁菌门（Firmicutes）中的芽孢杆菌属（Bacillus）为优势菌属。刘宁等[17]采用传统的微生物培养方法研究了中华通草蛉[Chrysoperla sinica（Tjeder）]成虫的肠道菌群构成，发现雌成虫的优势菌属为放线杆菌属（Actinobacillus），雄成虫的优势菌属为爱德华氏菌属（Edwardsiella）。张珊等[18]采用传统的微生物培养方法研究了思茅松毛虫（Dendrolimus kikuchii）4龄幼虫肠道可培养真菌，共分离鉴定出12株真菌，Pestalotiopsis microspora产蛋白酶活力最高，Penicillium chrysogenum产淀粉酶能力最高，Penicillium sclerotiorum产纤维素酶能力最高，Penicillium是优势菌属。王琼等[19]对文山松毛虫质型多角体病毒（Dendrolimus punctayusWenshanensis cytolplasmic polyhedrosis virus，DpwCPV）应 用SDS-热酚法抽提得到基因组dSRNA，最终获得了一个新的序列。江宇航等[20-21]采用传统的微生物培养方法研究了马尾松毛虫（Dendrolimus punctatus）幼虫肠道可培养产细菌素和产蛋白酶细菌，解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）产细菌素活性最佳，地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）产蛋白酶能力最高。而对云南松毛虫（Dendrolimus houi）肠道可培养真菌的研究发现，假丝酵母（Candida catenulate）和桔青霉（Penicillium）解纤维素酶活性在中性条件下最高[22]。对落叶松毛虫（Dendrolimus superans）和赤松毛虫（Dendrolimusspectabilis）的研究多集中于生物学特性及防控[23-26]。【本研究切入点】国内关于鳞翅目的其他昆虫肠道微生物多有报道，但关于思茅松毛虫成虫肠道细菌群落组成和多样性鲜见报道。需研究思茅松毛虫肠道细菌多样性。【拟解决的关键问题】将以思茅松毛虫成虫为研究对象，基于Illumina NovaSeq（PE250）平台运用高通量技术对思茅松毛虫成虫肠道细菌16S rDNA序列V3～V4高变区进行PCR扩增测序，分析对比思茅松毛虫雌雄成虫肠道微生物资源和多样性，为研究思茅松毛虫肠道微生物资源和其生物学功能以及思茅松毛虫的种群管理提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

思茅松毛虫虫茧采自云南省安宁市草铺镇森林地区（24°31′～25°6′N，102°8′～102°37′E），根据安宁市森林的情况在方圆3 hm2范围内随机挑选30个样品点，每个样品点采集10只健康的成虫（雌雄各5只），总计300只成虫，带回实验室饲养。图1

图1 思茅松毛虫雄成虫（A）、雌成虫（B）Fig.1 Male（A）and female（B）adults of Dendrolimuskikuchii

1.2 方法

1.2.1 肠道解剖及基因组DNA提取

选取健康的雄蛾和雌蛾各50头，在恒温（23±1℃）、恒湿（83%±2%）条件下，每5头幼虫放在一个小笼子内用无菌水喂养，40 h后待其排空体内食物残渣后进行实验。将成虫置于冰上3～5 min，待其昏迷；采用70%酒精擦拭虫体表面30 s，0.25%次氯酸钠冲泡1 min，无菌水冲洗3次；将体表消毒好的虫子固定于无菌蜡盘上，在无菌环境下操作，使用灭菌后的细尖钳将昆虫腹部剖开，取出整个肠道，并立即用0.9%无菌NaCl溶液冲洗表面2次，然后将肠道取出后置于无菌离心管中，进行液氮速冻，置于-80℃保存备用，每个样品设置3个重复。雌成虫编号CC1-3，雄成虫编号CX1-3。

采用E.Z.N.细菌DNA提取试剂盒参照其说明书分别提取雄蛾和雌蛾的肠道细菌总DNA，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检验抽提质量，检测合格后保存于-80℃冰箱中备用[27]。

1.2.2 DNA提取、PCR扩增和高通量测序

以提取的总DNA为模板，采用带Barcode（338F-806R）的特异引物338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′扩增细菌16S rDNA V3～V4区域[28]。PCR扩增反应体系（25.0µL）：基因组DNA模板2.0µL，5×reaction Buffer 5.0µL，5×GC Buffer 5.0µL，dNTP（2.5 mmol/L）2.0µL，338F/806R（10.0 mmol/L）各1.0µL，Q5 DNA Polymerase 0.25µL，ddH2O 8.75µL。PCR扩增条件：98℃预变性2 min，98℃变性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸5 min，30个循环，72℃终延伸5 min，-20℃保存。PCR扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，采用Axygen Gel Extraction Kit（AP-GX-250G）试剂盒割胶回收。检测合格后送至武汉贝纳科技服务有限公司基于Illumina NovaSeq（PE250）平台进行高通量测序。

1.3 数据处理

Illumina NovaSeq（PE250）测序获得的原始数据根据index序列区分数据，并保存为fastq格式[29]，根据测序所得双端序列PE reads的overlap关系将其拼接为一条序列，用FLASH、Trimmomatic软件对reads质量、拼接效果过滤，并区分样品，调整序列正反向，去除嵌合体序列，得到最终有效数据（valid tags）[30]。使用UPARSE[31]软件对Clean Tags在97%的相似度水平下进行聚类，获得OTU序列，并基于Silva128/16S_bacteria库进行比对，每个操作分类单元中把丰度最高的序列作为OTU代表，采用贝叶斯算法[32]对以上序列注释、分类，在各分类学水平上统计各样本群落组成[33]。使用Mothur（version v.1.30）软件对样品Alpha多样性指数（Chao1，Ace，Shannon和Simpson）进行分析。使用R语言绘制稀释曲线、Rank Abundance曲线和进行PCoA分析。使用Qiime软件（Version 1.9.1）计算Unifrac距离并构建UPGMA样品聚类树，使用LEfSe软件分析物种的差异性。

2 结果与分析

2.1 思茅松毛虫成虫肠道细菌基因序列拼接和OUT聚类

研究表明，6个样本共获得原始序列1 197 458条，有效序列1 172 405条，归为1 278个OTUs，注释到28个门，75个纲173个目，296个科，550个属。雄蛾有效序列389 048条，归为724个OTUs，雄蛾有效序列783 357条，归为994个OTUs。表1

表1 思茅松毛虫成虫肠道细菌测序的基本信息Table 1 Sequencing information gut bacteria in adults of Dendrolimuskikuchii

2.2 思茅松毛虫成虫肠道细菌种类组成及丰度

研究表明，在门分类水平上，思茅松毛虫雌蛾和雄蛾的肠道细菌优势菌门均为变形菌门（Proteobacteria），只是丰度不同。在科分类水平上，思茅松毛虫雌蛾和雄蛾的肠道细菌优势菌科不相同，雄蛾的优势菌科是鞘脂单胞菌科（Sphingomonadaceae）和丛毛单胞菌科（Comamonadaceae），雌蛾的优势菌科是欧文氏菌科（Erwiniaceae）和丛毛单胞菌科（Comamonadaceae）。在属分类水平上，思茅松毛虫雌蛾和雄蛾的肠道细菌优势菌属不相同，雄蛾的优势菌属是鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas），雌蛾的优势菌属是泛生菌属（Pantoea）。表2、图2～4

表2 思茅松毛虫雌雄成虫体内在门、科和属分类等级上相对丰度Table 2 Relative abundance at the levels of phylum,family and genus in female and male adults of Dendrolimuskikuchii（≥0.1%）

图2 思茅松毛虫成虫肠道细菌门水平相对丰度Fig.2 Histogram of relative abundance of the gut bacteria in adults of Dendrolimuskikuchii at the phylum level

图4 思茅松毛虫成虫肠道细菌属水平相对丰度Fig.4 Histogram of relative abundance of the gut bacteria in adults of Dendrolimuskikuchii at the genus level

雄蛾有366种细菌数，雌蛾有462种细菌属，二者共有的细菌属是272种，雌蛾的肠道细菌群落结构在属水平上比雄蛾更丰富，并且二者具有一定的相似性。图5

图5 思茅松毛虫成虫肠道细菌属水平韦恩图Fig.5 Venn diagram of the gut bacteria in adults of Dendrolimuskikuchii at the genus level

2.3 思茅松毛虫成虫肠道细菌多样性

研究表明，雌蛾和雄蛾的Coverage指数均为0.999 7，样本样本文库的覆盖率较高，进行测序分析有一定的代表性。雌蛾肠道细菌的Shannon指数（P＞0.05）、ACE指数（P＞0.05）、Chao1指数（P＞0.05）、Coverage指数（P＞0.05）均高于雄蛾，雌蛾肠道细菌的物种多样性比雄蛾丰富。表3

图3 思茅松毛虫成虫肠道细菌科水平相对丰度Fig.3 Histogram of relative abundance of the gut bacteria in adults of Dendrolimuskikuchii at the family level

表3 思茅松毛虫雌雄成虫体内在门、科和属分类等级上相对丰度Table 3 Relative abundance at the levels of phylum,family and genus in female and male adults of Dendrolimuskikuchii

CC1样本在水平方向上跨度最大，且在垂直方向上最平滑，雌蛾CC1样本肠道细菌菌群的组成最为丰富且物种分布的均匀度最高。CC3样本在水平方向上的跨度较CC1小，在垂直方向上没CC1平滑，CC1样本肠道细菌菌群的组成丰富度及物种分布的均匀度较CC1样本低。CC2样本在水平方向上跨度最大，且在垂直方向上最陡，雌蛾CC2样本肠道细菌菌群的组成最贫乏且物种分布的均匀度最低。而雄蛾样本CX2样本在水平方向上的跨度较CX2-CX3大，在垂直方向上较CX2-CX3平滑，CC1样本肠道细菌菌群的组成丰富度及物种分布的均匀度较较CX2-CX3样本高。OTUs随着reads数增加呈曲线状增加，先急速增加而后变缓。reads数增加可产生的OTUs极少。图6，图7

图6 思茅松毛虫成虫肠道细菌Rank abundance曲线Fig.6 Rank abundance curve of the gut bacteria in adults of Dendrolimuskikuchii

图7 思茅松毛虫成虫肠道细菌稀释曲线Fig.7 Observed species rarefaction curves of the gut bacteria in adults of Dendrolimus kikuchii

2.4 思茅松毛虫成虫肠道细菌差异比较

研究表明，CC1和CX1-CX3样本分布较近，而CC1-CC2和CX1-CX3样本分布较远，思茅松毛虫雄蛾和雌蛾的肠道细菌菌群结构既有相似的地方，也有不同的地方。图8

图8 思茅松毛虫成虫肠道细菌PCoAFig.8 PCoA map of the gut bacteria in adults of Dendrolimuskikuchii

雄蛾在丰度上有显著差异的物种有α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、鞘脂单胞菌目（Sphingomonadales）、鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）、鞘脂单胞菌科（Sphingomonadaceae）、乳球菌属（Lactococcus）、水杆状菌属（Aquabacterium）、柄杆菌科（Caulobacteraceae）、柄杆菌目（Caulobacterales）、不粘柄菌属（Asticcacaulis）、丛毛单胞菌科未鉴定到属unclassified_f__Comamonadaceae。雌蛾在丰度上有显著差异的物种有γ-变形杆菌纲（Gammaproteobacteria）、肠杆菌目（Enterobacteriales）、Enterobacterales、欧文氏菌科（Erwiniaceae）、泛生菌属（Pantoea）、摩根菌科（Morganellaceae）、Erysipelatoclostridiaceae、巨单胞菌属（Megamonas）、中华芽胞杆菌属（Sinibacillus）、欧文氏菌属（Erwinia）、真杆菌属（Eubacterium）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）。图9

图9 思茅松毛虫成虫肠道细菌分类差异(LEfSe)Fig.9 LEfSe analysis of the gut bacteria in adults of Dendrolimuskikuchii

3 讨论

大多数昆虫肠道微生物包括了细菌、真菌、古细菌和原生生物，而细菌丰度最高，约占90%以上，是其中的优势菌群[34]。成虫的优势菌门为变形菌门（Proteobacteria）。在属水平上，雄蛾的优势菌属是鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas），雌蛾的优势菌属是泛生菌属（Pantoea）。王争艳等[35]通过Illumina MiSeq高通量测序技术对赤拟谷盗（Tribolium castaneum（Herbst））成虫肠道的细菌群落组成及多样性研究发现，优势菌门包括变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）。王天召等[36]通过Illumina MiSeq高通量测序技术对褐飞虱（Nilaparvata lugens）成虫肠道的细菌群落组成及多样性研究发现，优势菌门包括变形菌门（Proteobacteria）、拟 杆 菌 门（Bacteroidetes）和 厚 壁 菌 门（Firmicutes）。孙博通等[37]采用传统的微生物培养方法研究了斜纹夜蛾（Spodoptera litura）幼虫肠道可培养细菌共分离得到10种细菌，其中优势菌群为形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）。王洪秀等[38]采用传统的微生物培养方法研究了膜翅目蜜蜂属（Apis）成虫蜜蜂肠道可培养肠道细菌发现，优势菌科是肠杆菌科（Enterobacteriaceae）。不同的种类的昆虫，其肠道的优势菌群也不同，与昆虫的食物、生存环境和昆虫种类等因素密切相关[12]。而孙佑赫等[39-40]、王金华等[41]和马艳芳等[42]分别对普洱市宁洱县磨黑镇思茅松毛虫4龄、5龄、6龄和7龄幼虫肠道细菌的研究中发现优势菌属为分别为短芽孢杆菌属（Brevibacillus）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、芽孢杆菌属（Bacillus）和肠杆菌属（Enterobacteer），不同时期思茅松毛虫肠道细菌随着昆虫的生长发育，肠道细菌优势菌群会有所变化，而同一时期的不同发育状态的成虫肠道优势菌群也不同。

鞘脂单胞菌科细菌生存能力强，能快速分解有机物，其比例与脲酶（一种催化尿素水解成氨和二氧化碳的酶，和生物体内氮代谢密切相关）活性显著正相关[43]。鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）细菌广泛存在于根际土壤内，能够降解纤维素，产生消化酶，能够利用木质素、纤维二糖、几丁质等芳香化合物进行生长，有助于昆虫的生长发育[44-46]。雄成虫在幼虫阶段可能具有消化松香和其它松树挥发性物质的能力，并且松香有生物毒性，可以抵抗松香内含有的重金属毒性。鞘氨醇单胞菌属可以产生胞外多糖，或者吸附在细胞膜表面作为脂多糖（LPS）的O-抗原，在细胞周围形成荚膜，对肠道会形成保护作用，荚膜形成的疏水表面更益于这些细菌在生态环境中的存活及芳香化物的摄取。泛生菌属（Pantoea）细菌广泛存在于土壤、植物、昆虫中，是一种植物致病菌，但作为昆虫重要的内共生菌，能够抵御病原菌的侵害，具有重要的免疫作用[47-50]。胡笑峰等[51]研究发现，欧文氏菌科（Erwiniaceae）细菌能够降解木质素，有助于昆虫的消化的作用。雌成虫在幼虫阶段可能以富含木质素的松木为食物，并且可能分解植物多糖为二糖或单糖，进而获取能量。丛毛单胞菌科（Comamonadaceae）细菌能稳定降解类固醇、多环芳烃类物质，产生一种重要的激素降解酶，能够降解激素，调控蛋白[52-53]。

变形菌是思茅松毛虫肠道丰度差异性最显著的菌门，雄成虫差异性最高的是alpha-变形菌纲，雌成虫差异性最高的是gamma-变形菌纲。α-变形菌大多都是革兰氏阴性菌，主要包括了鞘脂单胞菌目等细菌，松毛虫体内大多是内共生细菌，主要起降解含氮有机物作用[54]；γ-变形菌纲是所知的细菌中种类最多的一纲，包括了欧文氏菌，可以对含碳纤维素进行降解[55]；思茅松毛虫雌雄成虫肠道分解食物的侧重点有所不同，但是雌成虫也含有雄虫相似的菌类，雌成虫在幼虫阶段不但可以消化含碳纤维，也可以消化含氮物质，因而食谱更广。研究仅对思茅松毛虫成虫的肠道细菌组做了研究，关于肠道细菌的生物学功能等需要做进一步的研究。

4 结论

雄蛾和雌蛾的Shannon指数、Simpson指数、ACE指数、Chao1指数、Coverage指数分别为2.583 5、0.254 4、381.415 1、401.985 6、0.999 7；2.766 3、0.193 9、609.770 2、576.310 0、0.999 7，思茅松毛虫成虫肠道细菌群落组成和多样性丰富。其中，雄蛾和雌蛾的优势菌为变形菌门（Proteobacteria，雌81.27%/雄81.17%）；在科水平上，雄蛾的优势菌科是鞘脂单胞菌科（Sphingomonadaceae，49.16%）和丛毛单胞菌科（Comamonadaceae，19.09%），雌蛾的优势菌科是欧文氏菌科（Erwiniaceae，34.09%）和丛毛单胞菌科（Comamonadaceae，16.68%）；在属水平上，雄蛾的优势菌属是鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas，48.09%），雌蛾的优势菌属是泛生菌属（Pantoea，31.58%）。雄蛾肠道中丰度差异显著性最高的菌群为α-变形菌纲（Alphaproteobacteria），雌蛾肠道中丰度差异显著性最高的菌群为γ-变形杆菌纲（Gammaproteobacteria）。