苏木乙酸乙酯提取物对野百合碱诱导肺动脉高压大鼠肺动脉压、血浆BNP及肺小动脉的影响

常艳宾，李 雁，张丽丽，郑佳新

(黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150036)

肺动脉高压是一类以肺血管阻力进行性升高为主要特征，发病率、致死率及病死率都很高的心肺疾病。肺动脉高压的核心病理生理改变是持续性肺血管收缩、血管重构、原位血栓形成和血管周炎性浸润等，导致肺小动脉狭窄、肺循环阻力增加、右心负荷增大，最终导致右心功能衰竭和死亡[1-3]。目前，内皮素受体拮抗剂和前列环素类两种靶向药物给肺动脉高压患者的治疗带来了希望，二者代表药物如波生坦、万他维可在一定程度上降低肺动脉压，但由于费用昂贵，给患者带来了沉重的经济负担。因此，在肺动脉高压的治疗上仍需开发新型药物。既往研究表明，苏木乙酸乙酯提取物有免疫抑制、抗炎、抗动脉粥样硬化、抑制心肌细胞凋亡、增强心肌收缩力、稳定斑块等作用[4-8]，可保护心肌组织，但其对肺动脉高压是否具有防治作用还不明确。故本课题组通过观察苏木乙酸乙酯提取物对野百合碱致肺动脉高压大鼠肺动脉压、血浆脑尿钠肽(BNP)及肺血管重塑的影响，探讨了苏木乙酸乙酯提取物对肺动脉高压是否具有保护作用。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 雄性Sprague-Dawley大鼠，体重(200±10)g，购自黑龙江中医药大学实验动物中心，动物合格证编号：2014001XYXK。实验动物饲养按1989年卫生部发布的《医学实验动物管理实施细则》执行，在通风、温度及湿度适宜的环境下自由摄食、饮水。

1.2实验药物 苏木乙酸乙酯提取物由黑龙江中医药大学制剂室制备提供，将苏木乙酸乙酯提取物溶于羧甲基纤维素钠溶液，配制成浓度为73.6 mg/mL(低浓度)和147.2 mg/mL(高浓度)的药液，现用现配。阿魏酸钠购于黑龙江省哈尔滨博润生物公司(纯度为97%)，将阿魏酸钠粉末9 g溶于300 mL羧基纤维素钠溶液中，配制成浓度为30 mg/mL的溶液。

1.3主要试剂及仪器 野百合碱(C240l-600mg,Sigma公司)；苏木精-尹红染色液(北京，biosharp公司)，大鼠血浆BNP试剂盒(黑龙江省哈尔滨博润生物公司，批号：R-D140305)，美国RT-雷杜酶标仪(6100型，USA)，光学显微镜(日本OLYMPUS公司)，Q5100W病理图像分析系统(德国LEICA)。

1.4实验方法 采用完全随机化的分组方法将50只雄性SD大鼠分为空白组、模型组、苏木乙酸乙酯高剂量组、苏木乙酸乙酯低剂量组、阿魏酸钠组，每组10只。实验开始第1天，空白组腹腔注射生理盐水10 mL/kg；其余组大鼠参考文献[9]方法建立肺动脉高压模型：一次性腹腔注射1%的野百合碱溶液60 mg/kg(用2∶8的无水乙醇和生理盐水混合液配成，6 mL/kg，14～21 d即形成肺动脉高压)；第15天开始，空白组和模型组给予羧甲基纤维素钠溶液10 mL/(kg·d)灌胃,苏木乙酸乙酯高、低剂量组分别给予苏木乙酸乙酯提取物溶液1 472 mg/(kg·d)[生药量2.3 g/(kg·d)]、736 mg/(kg·d)[生药量1.15 g/(kg·d)]灌胃,阿魏酸钠组给予阿魏酸钠0.3 g/(kg·d)灌胃，均1次/d，连续灌胃至实验第28天。

1.5观察指标及方法

1.5.1各组大鼠一般情况 实验过程中观察各组大鼠的精神、活动、饮食、体重、死亡等情况。

1.5.2平均肺动脉压(mPAP) 参照刘文利[10]法测定mPAP：术前12 h大鼠均禁食，自由饮水,给予20%乌拉坦5 mL/kg腹腔注射后，将大鼠固定于手术板上，切开颈正中皮肤，分离出右静脉。将聚乙烯塑料软管充满肝素钠，一端连接右侧颈内静脉，依次插入右房、右室，到达肺动脉；另一端与压力换能器连接，并与心电监护系统相连，待压力波形稳定后，依据导管位置及监视器所示的压力波形图，依次实时记录肺动脉压，然后取其均值作为每只大鼠的mPAP。

1.5.3血浆BNP水平 完成肺动脉压测定后，用真空冷却抗凝试管从颈静脉中抽取血液，于低温离心机3 500 r/min离心(离心半径13.5 cm)后，分离血浆，应用ELISA法测定各组大鼠血浆BNP水平，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.5.4肺组织HE染色病理观察 将各组大鼠肺脏固定于10%中性福尔马林缓冲液中，经脱水、包埋、切片、染色、封片，光学显微镜下观察肺小动脉形态学改变，对终末细支气管伴行的肺小动脉管壁厚度运用图像分析系统进行分析，测量各标本肺小动脉管壁厚度、血管直径,每张切片均测量3～4个肺小动脉，取其平均值，计算管壁面积、血管面积，然后计算管壁厚度与血管外径百分比、管壁面积与血管面积百分比，评估管壁增厚程度及管腔狭窄程度。

2 结 果

2.1各组大鼠一般情况 空白组大鼠呼吸平稳，活泼好动，皮毛光亮，体重逐渐增加；造模各组大鼠腹腔注射MCT 7 d后活动减少，倦卧，食量减少，第14天开始出现皮毛枯槁、蜷缩，活动逐渐减少，出现喘息，体重增加明显减慢；模型组大鼠第21天出现鼻部及唇周发绀，开始有大鼠出现死亡；阿魏酸钠组、苏木乙酸乙酯高剂量组、苏木乙酸乙酯低剂量组大鼠实验20 d后精神状态开始好转，活动量逐渐增多，毛发较前光整，呼吸喘息减轻，食量及体重开始增加,苏木乙酸乙酯低剂量组和阿魏酸钠组好于苏木乙酸乙酯高剂量组，尤以苏木乙酸乙酯低剂量组改善明显。实验第28天，空白组大鼠均存活，模型组有5只存活，苏木乙酸乙酯高剂量组和阿魏酸钠组均有8只存活，苏木乙酸乙酯低剂量组有9只存活。其中模型组和阿魏酸钠组各有2只大鼠、苏木乙酸乙酯高剂量组有1只大鼠有不同程度的胸水和/或腹水。

2.2各组大鼠肺动脉压及血浆BNP水平比较 造模各组大鼠mPAP、血浆BNP水平均明显高于空白组(P均<0.05)；苏木乙酸乙酯高剂量组、苏木乙酸乙酯低剂量组和阿魏酸钠组大鼠mPAP、血浆BNP水平均明显低于模型组(P均<0.05)，苏木乙酸乙酯低剂量组与阿魏酸钠组比较差异均无统计学意义(P均>0.05),但均明显低于苏木乙酸乙酯高剂量组(P均<0.05)。见表1。

表1 空白组和肺动脉高压各组大鼠平均肺动脉压及血浆BNP水平比较

2.3各组大鼠肺组织及肺血管病理形态学表现 光学显微镜下观察：空白组大鼠肺动脉壁清晰，小动脉管壁内皮细胞扁平连续，厚薄较为一致，血管周围无炎性细胞浸润；模型组大鼠肺泡出现少量浆液性渗出，局部有炎性细胞浸润，肺小动脉壁增生，尤以平滑肌层增生显著，管腔变窄，血管内皮细胞变成不规则形状，血管内皮粗糙，血管内有浆液性渗出，并伴有充血，支气管腔内有少量浆液性渗出；阿魏酸钠组大鼠肺泡内出现大面积的浆液性渗出，渗出物呈现淡粉色，其中混有少量的红细胞以及脱落的肺泡上皮细胞，局部伴有炎性细胞浸润，肺小动脉扩张充血，小动脉壁厚度与模型组相比明显变薄，但与空白组相比增厚明显；苏木乙酸乙酯高、低剂量组大鼠肺小动脉壁厚度差异不大，但厚于空白组而薄于模型组和阿魏酸钠组。见图1。

图1 空白组和肺动脉高压各组大鼠肺血管病理切片HE染色表现(×100)

2.4各组大鼠肺小动脉管壁厚度及管腔狭窄程度比较 造模各组大鼠肺小动脉管壁厚度/血管直径、管壁面积/血管面积均明显高于空白组(P均<0.05)，苏木乙酸乙酯高剂量组、苏木乙酸乙酯低剂量组和阿魏酸钠组大鼠均明显低于模型组(P均<0.05)，且苏木乙酸乙酯高剂量组和苏木乙酸乙酯低剂量组均明显低于阿魏酸钠组(P均<0.05)，苏木乙酸乙酯高剂量组和苏木乙酸乙酯低剂量组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 空白组和肺动脉高压各组大鼠肺小动脉管壁厚度及管腔狭窄程度比较

3 讨 论

肺动脉高压的主要病理生理改变为肺血管结构重塑，病理学特征主要表现为肺动脉内膜增生、中膜肥厚及特征性丛样病变。其中免疫炎症因素在动脉型肺动脉高压形成及血管重塑过程中起着关键作用，病理观察显示重构的肺动脉周围炎症细胞浸润明显，包括肥大细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞及树突状细胞[11-12]。本实验结果显示，模型组大鼠肺泡及支气管腔内有少量浆液性渗出，局部有炎性细胞浸润，肺小动脉平滑肌层增生显著，管腔变窄，血管内有浆液性渗出，并伴有充血，说明野百合碱造模诱发肺动脉高压后导致大鼠肺血管重塑，产生免疫炎症。苏木乙酸乙酯提取物高、低剂量组大鼠肺泡浆液性渗出较少，局部炎性细胞浸润、肺小动脉壁增生及管腔变窄程度较模型组轻，说明苏木乙酸乙酯提取物可有效逆转肺血管的重塑及抑制炎性渗出。

BNP与心力衰竭、急性冠脉综合征、肺源性心脏病等心血管疾病关系密切。BNP的释放与肺动脉高压程度呈正相关，BNP水平可以较为准确地评估机体肺动脉高压的程度及肺血管重塑情况[13-14]。本实验结果显示，模型组大鼠mPAP及血浆BNP水平均明显高压空白组，而BNP水平与右心功能关系密切，说明模型大鼠存在右心功能明显下降。与模型组比较，苏木乙酸乙酯提取物高、低剂量组大鼠mPAP及血浆BNP水平均有不同程度的降低，说明苏木乙酸乙酯提取物可降低肺动脉压力、右室容量及压力负荷，减少BNP的合成和分泌，避免BNP的生物学作用，改善心室功能。

综上所述，苏木乙酸乙酯提取物可通过逆转野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠的肺血管重塑及降低血浆BNP水平，达到降低肺动脉压力及改善心功能的目的，但其具体的作用机制尚不明确，还需进一步研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。