小麦TaPR1 基因启动子的克隆及启动活性分析

王丽珊，王 珅，王 菲，王海燕，刘大群

(1.河北农业大学 植物保护学院/河北省农作物病虫害生物防治技术创新中心，河北 保定 071000； 2.河北省农林科学院 粮油作物研究所/河北省作物遗传育种实验室，河北 石家庄 050035）

PR1 是 病 程 相 关（Pathogenesis related，PR）蛋白家族成员，具有抗真菌、抗病毒功能，帮助植物抵抗逆境胁迫，同时也是病原物诱导的系统获得性 抗 性（Systemic acquire resistance，SAR）防 御信号获得的标志。刘玉晴等［1］在研究植物激素对水稻OsPR1A 表达的影响时发现，茉莉酸甲酯处理后的水稻幼苗在接种水稻白叶枯菌（Xanthomonas oryzae，Xoo）后6 d，OsPR1A 大量表达，病斑生长受到明显抑制；Van 等［2］发现拟南芥中编码PR1蛋白的22 个基因中，只有1 个PR1基因在受到细菌及激素诱导时提高表达；符晓等［3］发现大薯中6个DaPR1基因在炭疽菌侵染时表达量均显著提升。

本课题组前期利用Southern 杂交试验验证了TaPR1在小麦基因组中包含4 个拷贝，利用‘中国春’缺体- 四体系明确该基因定位于7D 染色 体［4］；Gao［5］发现当受到信号分子脱落酸（Abscisic acid，ABA）诱导12 h 时，TaPR1基因出现明显的上调表达，表达量是0 h 的3.1 倍；水杨酸（Salicylic acid，SA）诱导后72 h，TaPR1基因出现表达高峰，是0 h 的5.4 倍。栗小英［6-7］发现TaPR1基因在叶锈菌侵染小麦12 h 后出现第1 个表达高峰，第2 个表达高峰出现在120 h，该基因在根、茎中的表达量远远低于在小麦叶片中的表达量，在小麦抗叶锈病近等基因系TcLr35 中，TaPR1的表达量随着植株生长而增加。张家瑞［8］利用基因枪将亚细胞定位重组体pCamA-TaLr35PR1-GFP 转化进入洋葱表皮细胞，发现TaPR1 蛋白定位在细胞外，且利用酵母系统验证TaPR1基因所携带的信号肽具有分泌活性。申松松等［9］利用GST-Pull down 及酵母双杂交技术筛选到谷氨酰氨合成酶（Glutamine synthetase）、细胞色素b6（Cytochrome b6）、应激蛋白（Stress protein）等小麦中与TaPR1 互作的蛋白。王菲等［10］利用VIGS 及体外抑菌试验证明TaPR1 能够有效抑制叶锈菌的生长，且TaPR1 能够通过与TaTLP1 的互作增强小麦抗叶锈病的能力。

前期已经明确TaPR1基因参与小麦抗叶锈病防御反应，然而对于调控TaPR1基因表达的转录调控因子了解甚少。因此，本研究拟通过克隆小麦TaPR1基因上游启动子序列，对其所包含的顺式作用元件进行分析预测，利用β-葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUS）组 织 化 学 染 色、绿 色荧 光 蛋 白（Green fluorescent protein，GFP）验 证 2 200 bp、900 bp 及290 bp 3 种不同长度启动子序列启动活性，以期明确具有较强启动活性的区域用于后续试验，为进一步解析TaPR1基因转录调控机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

植物材料为小麦抗叶锈病近等基因系材料TcLr19， 本 氏 烟； 植 物 表 达 载 体 为pBI121 和pCamA，均由河北农业大学植物病害生物防治和分子植物病理学实验室提供。无缝克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，GUS 染色试剂盒购自华越洋生物（北京）科技有限公司。

1.2 试验所需引物

本试验所有引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 用于启动子克隆与启动活性分析的特异性引物Table 1 Primers for promoter cloning and activation activity analysis

1.3 pTaPR1 的克隆及序列分析

本研究前期已经明确TaPR1基因定位于7D 染色体［4］，根据‘中国春’小麦基因组数据库（http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index）信息，获得位于7D 染色体上TaPR1基因上游2 200 bp 序列，利用primer 5.0 设计特异性引物T-pro-TaPR1-F2200和T-pro-TaPR1-R。 以TcLr19 DNA 为模板进行扩增，连接载体pMD19-T 测序后序列比对，利用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）进行顺式元件的预测。根据PlantCARE 预测结果，结合前期研究［5］中TaPR1对ABA 及SA 的特异性响应，针对ABA 信号通路响应元件ABRE 以及SA 信号通路响应元件As-1，对pTaPR1进行5′端分段缺失。

1.4 植物表达载体的构建及烟草瞬时转化

参考无缝克隆试剂盒说明书完成启动活性验证 载 体pBI121-pTaPR12200、pBI121-pTaPR1900、pBI121-pTaPR1290、pCamA-pTaPR12200、pCamApTaPR1900及pCamA-pTaPR1290的构建。利用冻融法将连接产物转入农杆菌菌株GV3101，PCR 方法鉴定阳性克隆，挑取阳性克隆，利用含有利福平（50 μg/mL）及卡那霉素（50 μg/mL）的LBman 震荡培 养15 h，3 000 r/min 离 心15 min，重 悬 沉 淀 至OD600=0.8，注射本氏烟，避光培养48 h。

1.5 GUS 染色

设置未携带质粒的农杆菌GV3101为阴性对照，阳性对照携带pBI121 空载体。48 h 后取烟草叶片进行GUS 组织化学染色，利用打孔器对叶片取样，按照说明书配置GUS 染色工作液，将样品浸泡于GUS 染色液中，放置在37 ℃培养箱，染色期间全程避光。20 h 后利用75%酒精对样品进行脱色处理，至叶片叶绿素完全褪去，此时阴性对照呈白色，观察试验组叶片染色情况。

1.6 荧光观察

设置pCamA 空载体为阳性对照，未携带质粒的农杆菌GV3101 为阴性对照。48 h 后利用荧光显微镜观察烟草叶片中GFP 荧光表达情况。剪取适量被侵染烟草叶片制作玻片，利用尼康Ti2-U 倒置荧光显微镜对烟草叶片下表皮进行荧光观察，波长选择490 nm，曝光时长设置为600 ms，拍照记录细胞中绿色荧光表达情况。

2 结果与分析

2.1 pTaPR1 的克隆

利用引物T-pro-TaPR1-F2200和T-pro-TaPR1-R进 行 扩 增 后，获 得1 条 约2 300 bp 的 扩 增 条 带（见图1），与预期大小一致，成功构建重组载体T-pTaPR1，测序分析结果表明，序列中包括扩增用特异性引物T-pro-TaPR1-F2200和T-pro-TaPR1-R，全长共2 323 bp。BLAST 比对结果显示，扩增片段3′端113 bp 与TaPR1基因ORF 区5′端113 bp 相似性为100%，证明克隆得到的2 200 bp 位于TaPR1基因上游5′端，暂命名为pTaPR1，将此序列确定为后续研究目标。

图1 pTaPR1 扩增结果Fig .1 Amplification results of pTaPR1

2.2 pTaPR1 顺式作用元件分析

利用PlantCARE 对序列进行顺式作用元件的分析，发现TaPR1基因上游启动子序列中包含启动子核心元件TATA-box、CAAT-box，还含有能够其他功能响应元件，如-1 960 bp、-1 482 bp、-436 bp、-284 bp 位置上响应SA 的AS-1 作用元件， -2 008 bp 位 置 上AACCTAA 序 列 的MYB 转 录 因子结合位点MRE，-2 200 bp 位置的WRKY 转录因 子 结 合 位 点W-box，-840 bp、-593 bp、-630 bp、-434 bp 位 置 的4 个ABA 响 应 元 件ABRE， -443 bp 的低温响应元件LTR，3 个无氧诱导响应元件ARE 分别在-1 816 bp、-1 347 bp、-867 bp，参与胚乳特异性表达的AACA_motif 作用元件在-220 bp，-164 bp 位置上游调控分生组织特异性表达元件CAT-box 等（见图2）。

图2 pTaPR1 顺式作用元件预测Fig . 2 Prediction of cis-acting elements in pTaPR1

2.3 pTaPR1 启动活性检测

2.3.1pTaPR1的分段 根据PlantCARE 预测结果，结合前期研究［5］中TaPR1对植物激素ABA 及SA的特异性响应，针对元件ABRE 以及AS-1 的位置对pTaPR1进行5′端缺失分段，将pTaPR1分为pTaPR12200、pTaPR1900及pTaPR12903 种不同区段。利用无缝克隆构建重组载体，电泳结果表明，各体系扩增产物大小分别为2 200、900 和290 bp（见图3），与预期大小一致。测序结果表明，成功构建重 组 载 体pBI121-pTaPR12200、pBI121-pTaPR1900、pBI121-pTaPR1290、pCamA-pTaPR12200、pCamApTaPR1900及pCamA-pTaPR1290，可用于后续试验。

图3 重组载体菌液PCR 验证Fig. 3 PCR products of recombined vectors

2.3.2 GUS 活性检测 将重组载体pBI121-pTaPR12200、pBI121-pTaPR1900、pBI121-pTaPR1290分别转入农杆菌，注射烟草，GUS染色结果显示，阴性对照（未携带质粒的农杆菌GV3101）酒精脱色后叶片呈白色，表明烟草叶片中无GUS基因本底表达；携带质粒pBI121 的农杆菌为阳性对照，该组烟草叶片呈蓝色，表明GUS基因在35S 启动子的启动下，在烟草叶片中正常表达；携带重组载体pBI121-pTaPR12200和pBI121-pTaPR1900的农杆菌侵染烟草叶片，脱色后的叶片显蓝色，证明2 200 bp 和900 bp 的pTaPR1具有启动活性（见图4）；携带重组载体pBI121-pTaPR1290的农杆菌侵染烟草叶片，脱色后叶片显白色，证明290 bppTaPR1无法启动下游GUS基因表达。

图4 pTaPR1 驱动GUS 基因的表达验证Fig. 4 Validation of the expression of GUS gene driven by pTaPR1

2.3.3 GFP 荧光观察 将重组载体pCamA-pTaPR12200、pCamA-pTaPR1900、pCamA-pTaPR1290分别转入农杆菌，注射烟草，GFP 荧光观察结果显示，阴性对照（未携带质粒的农杆菌GV3101）叶片在荧光场下无可见绿叶荧光，表明烟草叶片中GFP基因无本底表达；携带质粒pCamA 农杆菌为阳性对照，叶片在荧光场可观察到绿色荧光，细胞核及细胞轮廓清晰可见，表明GFP基因在35S 启动子的启动下，在烟草叶片中正常表达；当农杆菌携带重组载体pCamApTaPR12200和pCamA-pTaPR1900侵染烟草叶片，荧光场中可观察到绿色荧光，GFP基因正常表达，pTaPR12200和pTaPR1900具有启动活性；当农杆菌携带重组载体pCamA-pTaPR1290侵染烟草叶片，无法观察到绿色荧光，290 bppTaPR1不能激活GFP基因表达，pTaPR1290无启动活性（见图5）。

图5 烟草叶片的GFP 荧光观察Fig. 5 GFP fluorescence observation of tobacco

3 讨论与结论

5′端缺失分段是寻找启动子启动活性关键区段的有效方法。董向向等［11］克隆获得草莓开花控制基因ARF4基因启动子，在顺式作用元件预测的基础上进行缺失分段，利用GUS染色分析启动子表达的特异性，确定生长素和赤霉素是影响ARF4基因启动子转录活性的因素；石翠翠等［12］利用启动子分段克隆的方法，寻找拟南芥AtRPK1启动子启动关键区域，利用5′端缺失的方法得到不同长度的片段，分别构建表达载体，转入拟南芥验证启动活性，发现809 bp 启动子启动的基因在各组织中均有表达，具有较高启动表达的能力；柴春月等［13］研究发现GmDRRP基因表达受激素的抑制，克隆上游1 500 bp 启动子区，发现该区域包含多个已知逆境响应相关的顺式元件，启动活性验证试验表明拟南芥接种疫霉菌0.5 hGmDRRP启动子快速相应诱导，2 h 后报告基因表达量显著上升，222 bp 片段对疫霉的诱导响应能力是全长启动子的34%；杨少华等［14］研究发现甘薯IbMYB1基因启动子的关键区域位于 -2 183 ～-1 000 bp 区 段； 李 静［15］发 现 大 豆GmCBL6基因启动子关键区域位于-969 ～-769 bp区段。本试验为验证TaPR1基因启动子具有启动活性的具体功能区域，利用GUS 染色及GFP 荧光观察 对pTaPR12200、pTaPR1900和pTaPR1290进 行 启 动活性验证，结果发现仅有pTaPR12200和pTaPR1900能够驱动下游报告基因的表达，表明TaPR1基因启动子活性的主要功能区域位于-2 200 ～-290 bp 区段。

启动子在上游转录调控区中含有特殊的顺式调控元件，这些调控元件通常可通过与某些特定的刺激信号分子结合，从而赋予启动子特定的调控和表达方式。顺式作用元件As-1 在基因响应SA 诱导时发挥重要作用，1989 年，Eric［16］发现As-1 元件是决定CaMV35S 启动子启动活性的关键区域；Qin 等［17］利用启动子区域点突变构建GUS基因融合表达载体，通过验证不同激素诱导情况下转基因植株中GUS基因的表达，发现As-1 顺式作用元件是35S 启动子响应SA 诱导的关键元件。在目前确认到的具有启动活性的pTaPR1 中，存在3 个SA 信号通路TGA 转录因子结合位点As-1，猜测是该顺式作用元件在调控TaPR1基因转录过程中发挥重要作用，本研究结果将为后续解析TaPR1 基因转录调控机制奠定基础。