海藻酸钠覆膜革胡子鲶鱼肉冷藏期间品质变化及与微生物多样性间相关性分析

罗云龙，王 洋，2，，刘 义，张光晨，白东清，2，施 杭，蒋思思，马俪珍

（1.天津农学院水产学院，天津 300384；2.天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384；3.贵州食品工程职业学院食品工程系，贵州 贵阳 551400）

革胡子鲶（）生长速度快，对环境胁迫的耐受力强，是我国经济淡水养殖鱼类之一。革胡子鲶肉质细腻，适合制作烤鱼、焖锅，受到餐饮业的欢迎和消费者的喜爱，其鱼肉也有开发为鱼糜的潜力。然而由于革胡子鲶鱼肉易腐败，目前还没有冷鲜或冰鲜鱼肉产品上市。王苗苗发现，真空包装及气调包装冰温冷藏革胡子鲶鱼肉的优势腐败菌为乳酸菌、假单胞菌和气单胞菌，而托盘包装冷藏革胡子鲶鱼肉的优势腐败菌为假单胞菌和产HS菌。可见不同包装方式的革胡子鲶鱼肉主要腐败菌有所差异，而腐败菌生长情况是预测产品货架期及确定保鲜方案的主要依据。因此，探究革胡子鲶鱼肉优势腐败菌的组成和变化，对于针对性防控并延长货架期具有重要意义。

可食性材料覆膜能够有效抑制食品的氧化变质，还可装载抑菌成分，延缓微生物繁殖，从而延长鱼肉货架期。海藻酸钠涂膜还能改变水产品的微生物组成，对假单胞菌、产HS菌、肠杆菌与乳酸菌均有抑制作用。预实验初步证实了革胡子鲶鱼肉覆膜保鲜及装载抑菌物质的可行性。本研究旨在探讨海藻酸钠覆膜革胡子鲶鱼肉微生物多样性变化及其与品质的相关性，为进一步研究可食性膜装载抑菌物质、延长革胡子鲶鱼货架期提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活革胡子鲶 天津市红旗农贸批发市场。

食品级海藻酸钠、氯化钠、甘油、硼酸（均为分析纯） 天津北方天医化学试剂厂；平板计数培养基北京奥博星生物技术有限公司；氯化钙、盐酸、氢氧化钠、三氯乙酸（均为分析纯） 天津风船化学试剂科技有限公司；氧化镁（分析纯） 天津津科精细化工研究所；2-硫代巴比妥酸（分析纯） 北京索莱宝科技有限公司；丹磺酰氯（分析纯） 天津科润达生物工程研究有限公司；生物胺（色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺及亚精胺）标准品 美国Sigma公司；乙腈（色谱纯） 美国Bioreags公司。

1.2 仪器与设备

AR224CN电子天平 上海奥豪斯仪器有限公司；ST 16R高速冷冻离心机 赛默飞世尔科技有限公司；SCIENTZ-192高速匀浆研磨器 宁波新芝生物科技股份有限公司；SKD-800自动凯氏定氮仪 上海沛欧分析仪器有限公司；DK-600S恒温水浴锅 上海精密实验设备有限公司；SHZ-D循环水式真空泵 上海力辰仪器科技有限公司；GS0610超声波清洗机 深圳博冠科技有限公司；SX-500多功能高压蒸汽灭菌锅 日本Tomy公司；1260高效液相色谱仪（配备紫外吸收检测器） 美国Agilent公司；CR-400比色仪 日本Konica Minolta公司；FE20/EL20数字式pH计 梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；UV-2600分光光度计日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 可食用膜的制备

根据Rhim的方法，制备海藻酸钠膜。以1 g/100 mL海藻酸钠水溶液、体积分数0.5%甘油和0.2 g/100 mL氯化钙作为食用膜的基本溶液，在室温（20 ℃）下搅拌30 min，将溶液倒在玻璃板上，室温下干燥48 h，得到厚度40～60 μm的膜，置于相对湿度53%、温度20 ℃的干燥器中待用。

1.3.2 鱼片处理

鲜活革胡子鲶鱼低温休眠后敲头至死，自来水流水洗去血水，去除内脏和鱼皮。取两侧鱼肉，去掉皮下脂肪，切成30 g左右的小块，将鱼肉裹上海藻酸钠膜，之后用聚乙烯薄膜袋包装（20 ℃条件下氧气渗透系数约为15 181.9 mL/（m·d·101 Pa），透湿率约为4.531 8 g/（m·d）），在4 ℃条件下冷藏10 d。于冷藏0、2、4、6、8、10 d随机抽取样品进行感官评价、理化性质测定和微生物多样性分析。

1.3.3 感官分析

从鱼肉中随机取样，评价其气味、色泽、汁液流失和质地，分数均为1～5 分，5 分代表质量最好，分数越低代表质量越差。上述4 种指标分数之和为可接受度评分，总分小于10 分时不可接受。7 位评定人员参与感官评估。

鱼肉的亮度值（）、红度值（）、黄度值（）和色差值（Δ）用比色仪测定。

1.3.4 理化性质测定

1.3.4.1 持水力参照冯慧等的方法。取约2.0 g（，g）捣碎的鲶鱼肉放入离心管，3 000×、4 ℃离心15 min，倒掉水分，称质量（，g），按下式计算持水力。

1.3.4.2 pH值

参照GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》方法，用数字式pH计测定鲶鱼肉pH值。

1.3.4.3 总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量

参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》方法。

1.3.4.4 硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARs）值

参照Witte等的方法。

1.3.4.5 生物胺含量

依据陈援援等的方法进行样品制备和提取，采用高效液相色谱法测定。

1.3.5 微生物数量及多样性分析

委托北京奥维森基因科技有限公司，用绝对定量法测定冷藏0、4、8 d鱼肉中目的基因拷贝数，使用Illumina MiSeq高通量测序技术进行16S rRNA V～V区序列分析。通用扩增引物为338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGC-3’）和806R（5’-GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）。

1.4 数据处理

感官分析及理化指标测定结果以平均值±标准差表示。采用SPSS 20.0软件（SPSS Inc.，Chicago，USA）进行单因素方差分析，采用Duncan’s检验进行方差分析（=0.05）。

2 结果与分析

2.1 海藻酸钠覆膜革胡子鲶鱼肉冷藏过程中感官品质变化

图 1 海藻酸钠覆膜革胡子鲶鱼肉冷藏过程中感官评分变化Fig. 1 Changes in sensory evaluation scores of sodium alginate-coated catfish flesh during cold storage

由图1可知，海藻酸钠覆膜革胡子鲶鱼肉冷藏过程中色泽和汁液流失评分快速下降，质地和气味的劣变略有延迟，在冷藏4 d后开始快速劣化。总体可接受度评分逐渐下降，6 d时降低到12 分，8 d降低到8 分，低于感官货架期标准（10 分）。

表 1 海藻酸钠覆膜革胡子鲶鱼肉冷藏过程中的色差值变化Table 1 Changes in color parameters of sodium alginate-coated catfish flesh during cold storage

由表1可知，冷藏0～4 d，海藻酸钠覆膜革胡子鲶鱼肉各项颜色指标均没有显著变化。冷藏6 d时下降，、Δ显著升高（＜0.05）。冷藏6～10 d，鱼肉的持续上升，说明鱼肉色泽变黄。

2.2 海藻酸钠覆膜革胡子鲶鱼肉冷藏过程中理化指标变化

图 2 海藻酸钠覆膜革胡子鲶鱼肉冷藏过程中理化指标变化Fig. 2 Changes in physicochemical indexes of sodium alginate-coated catfish flesh during cold storage

由图2A可知，革胡子鲶鱼肉冷藏4～6 d，持水力下降显著（从80.28%降至77.38%，＜0.05），冷藏0～4 d和6～10 d没有显著变化。由图2B可知，革胡子鲶鱼肉初始pH值为6.62，冷藏0～8 d持续降低，4～6 d下降幅度最大，8 d降至最低（5.66），10 d与8 d相比明显升高。由图2C可知，革胡子鲶鱼肉的TVB-N含量在冷藏初期维持在较低水平，冷藏6 d开始快速增加，冷藏8～10 d迅速增加，最终达到30.69 mg/100 g，超过国标限量（25 mg/100 g）。由图2D可知，革胡子鲶鱼肉TBARs值在冷藏期间缓慢升高，从0 d的0.30 mg/kg上升至10 d的0.84 mg/kg。

表 2 海藻酸钠覆膜革胡子鲶鱼肉冷藏过程中生物胺含量变化Table 2 Changes in contents of biogenic amines in sodium alginatecoated catfish flesh during cold storage

由表2可知，鲶鱼肉中生物胺总含量在冷藏期间逐渐增加，由8.51 mg/kg上升至141.04 mg/kg。8 种生物胺中，尸胺、腐胺、酪胺和组胺在冷藏末期含量最高，前3 种生物胺冷藏10 d含量分别达到35.02、69.84、15.79 mg/kg。组胺含量在冷藏0～4 d均低于检测限（0.005 mg/kg），冷藏6 d时开始增加，10 d时升至14.59 mg/kg。鱼肉中色胺、亚精胺含量有一定波动，但含量一直较低（不超过4 mg/kg），苯乙胺、精胺含量也较低，且在冷藏期间没有显著变化。

2.3 海藻酸钠覆膜革胡子鲶鱼肉冷藏过程中微生物多样性变化

由图3A可知，革胡子鲶鱼肉样初始微生物总数量为6.75（lg（CFU/g）），冷藏4 d升至8.37（lg（CFU/g）），8 d为8.08（lg（CFU/g））。由图3B可知，冷藏0、4、8 d共有OTU有76 个，冷藏初始特有OTU数量最多，为438 个，冷藏4、8 d特有OTU分别为26、37 个。由图3C可知，革胡子鲶鱼肉微生物多样性在冷藏4、8 d显著低于初始水平。由图3D可知，主成分分析显示，革胡子鲶鱼肉冷藏0、4、8 d时的微生物群落组成不同，冷藏0 d样本微生物组成与冷藏4、8 d样本聚类在不同区域。

由图3E可知，革胡子鲶鱼肉冷藏0、4、8 d时优势菌组成不同。冷藏0 d优势菌为莫拉氏菌科（Moraxellaceae，50.04%）、链球菌科（Streptococcaceae，23.79%）、黄杆菌科（Flavobacteriaceae，8.12%）和假单胞菌科（Pseudomonadaceae，3.70%）；冷藏4 d优势菌为链球菌科（33.04%）、希瓦氏菌科（Shewanellaceae，21.73%）、莫拉氏菌科（19.90%）、假单胞菌科（15.51%）和李斯特氏菌科（Listeriaceae，5.89%）；冷藏8 d为链球菌科（53.13%）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）（18.16%）、希瓦氏菌科（8.67%）、莫拉氏菌科（4.00%）、扁球菌科（Planococcaceae，3.36%）和葡萄球菌科（2.03%）。

图 3 海藻酸钠覆膜革胡子鲶鱼肉冷藏过程微生物多样性及组成变化Fig. 3 Changes in microbial community diversity and composition in sodium alginate-coated catfish flesh during cold storage

由图3F可知，LEfSe（LDA Effect Size）分析显示了鲶鱼肉在冷藏0、4、8 d间相对丰度均有显著差异的微生物。冷藏0 d相对丰度差异显著的微生物种类最多，包括10 个科、13 个属；冷藏4 d差异微生物为希瓦氏菌属（）、假单胞菌属（）；冷藏8 d差异微生物共2 个科（扁球菌科、链球菌科）、4 个属（库特氏菌属、明串珠菌属、摩根氏菌属、邻单胞菌属）。

2.4 海藻酸钠覆膜革胡子鲶鱼肉冷藏过程中微生物与理化指标相关性分析

图 4 海藻酸钠覆膜革胡子鲶鱼肉冷藏过程中微生物数量与理化指标相关性（A）及冗余分析结果（B）Fig. 4 Correlation between microbial counts and physicochemical parameters of sodium alginate-coated catfish felsh during cold storage (A)and redundancy analysis (B)

表 3 环境因素与群落结构的相关系数Table 3 Correlation coefficient between environmental factors and microbial community structure

对相对丰度大于1%的属水平微生物绝对数量与理化因子进行Pearson相关性分析。由图4可知，乳球菌属的绝对数量与样本的各理化因子均有显著相关性（＜0.05），与组胺、酪胺含量、、Δ呈极显著正相关（＜0.001，＞0.8），与持水力、pH值呈极显著负相关（＜0.01，＞0.8）。而不动杆菌属、嗜冷杆菌属、链球菌属、黄杆菌属、金黄杆菌属与理化指标的相关性则与乳球菌属基本相反。

不动杆菌属与TVB-N含量、、呈极显著负相关。嗜冷杆菌属、黄杆菌属与TBARs值、腐胺、尸胺、总胺含量呈极显著负相关，与pH值（除黄杆菌属）、呈极显著正相关。链球菌属、金黄杆菌属与理化指标的相关性基本相同，它们与腐胺含量呈极显著负相关，与呈极显著正相关。不同冷藏时间微生物绝对数量之间的相关性显示，乳球菌属丰度与库特氏菌属呈极显著正相关，金黄杆菌属与链球菌属、黄杆菌属之间互为极显著正相关。

冗余分析（图4B、表3）显示，所选理化指标共解释了93.9%的微生物变化信息，其中AX1与AX2的特征值分别为0.446和0.346，累计解释79.2%的变化信息。微生物数量、理化因子间的相关性与Pearson相关性分析结果相符。

3 讨 论

3.1 海藻酸钠覆膜革胡子鲶鱼肉冷藏过程中理化指标的变化

本研究监测冷藏期间革胡子鲶鱼肉持水力、pH值、TVB-N含量、TBARs值和生物胺含量的动态变化。结果表明，各项理化指标均从冷藏4 d开始变化速率加快，这与微生物在冷藏4 d时数量增加的趋势一致。革胡子鲶鱼肉持水力在冷藏4～6 d显著降低，有研究认为肌原纤维蛋白变性及pH值降低会导致鱼肉持水力下降。本研究亦发现pH值与持水力有正相关性。根据文献报道，鱼肉贮藏过程中pH值的降低源于糖原的分解和二氧化碳的溶解，而pH值的升高主要是由于鱼肉中腐败细菌产生的氨和其他挥发性碱。此外，产酸腐败菌的繁殖也会造成食品pH值下降。本研究中革胡子鲶鱼肉pH值在冷藏4～8 d的快速下降可能与乳球菌属的生长和代谢有关，而在冷藏8～10 d pH值的上升则与TVB-N含量和生物胺在此时段快速上升的趋势相吻合。

TVB-N含量是衡量水产品质量的重要指标。国标规定淡水鱼类TVB-N含量不高于20 mg/100 g。本研究中革胡子鲶鱼肉初始TVB-N含量较低，但在8～10 d快速增加并超过了食用上限，TBARs值在冷藏期间逐渐升高，但始终未超过1.0 mg/kg，表明脂肪氧化不是限制覆膜革胡子鲶鱼肉货架期的关键因素。本研究检测到的主要腐败生物胺为腐胺、尸胺、酪胺和组胺，组胺在鱼肉腐败时含量未超过安全上限。

3.2 海藻酸钠覆膜革胡子鲶鱼肉冷藏过程中微生物多样性及组成

鱼肉腐败与微生物的数量和组成密切相关。本研究分析了海藻酸钠覆膜革胡子鲶鱼肉在4 ℃条件下冷藏的微生物多样性和组成。发现鱼肉中微生物的多样性在冷藏0 d最高，之后显著降低，这与Zotta等研究结果一致，是优势菌生长所致。本研究中革胡子鲶鱼肉腐败时优势菌有莫拉氏菌科、链球菌科、假单胞菌科、希瓦氏菌科、肠杆菌科及扁球菌科。在属水平上，乳球菌属、邻单胞菌属、摩根氏菌属、希瓦氏菌属和假单胞菌属在冷藏4、8 d的鱼肉中相对丰度较高，这些菌均为鱼肉中常见腐败菌。已有研究表明，包装方式对鱼肉特征腐败菌有重要影响。假单胞菌、希瓦氏菌是鱼肉有氧包装的优势腐败菌，而气调包装鱼肉中乳酸菌、肠杆菌和热杀索丝菌为优势菌。本研究中，革胡子鲶鱼肉冷藏4 d时优势腐败菌为假单胞菌和希瓦氏菌，与托盘包装冷藏鲶鱼肉的优势腐败菌相似。但是在冷藏8 d时，革胡子鲶鱼肉乳球菌、肠杆菌的相对丰度显著上升，而希瓦氏菌相对丰度显著降低，可能是微生物代谢影响了包装中气体成分，从而抑制了好氧菌的生长。

3.3 海藻酸钠覆膜革胡子鲶鱼肉冷藏过程中微生物和理化指标的相关性

微生物间的相互作用是影响鱼肉微生物组成的重要因素之一。本研究发现，乳球菌属、库特氏菌属、希瓦氏菌属、热杀索丝菌属间的相对丰度呈正相关。金黄杆菌属、链球菌属、黄杆菌属与嗜冷杆菌属四者互为正相关。黄杆菌和嗜冷杆菌在鱼肉中十分常见，是冰鲜鳕鱼的主要腐败菌。Zotta等发现，0 ℃或10 ℃冷藏鳕鱼及鲽鱼肉中的黄杆菌属与嗜冷杆菌属含量均呈正相关。

明确理化因子与微生物间的相关性对防腐保鲜有重要意义。本研究发现，在所有相对丰度大于1%的微生物中，乳球菌属数量与腐败相关的各理化因子，包括组胺、酪胺、腐胺、尸胺、TVB-N含量、TBARs值呈显著正相关，与pH值呈显著负相关。乳球菌属是淡水鱼腐败菌之一，有产生物胺能力，其丰度随冷藏时间延长而升高。鱼乳球菌（）是一种具有腐败活性的嗜冷乳酸菌，能够造成鲑鱼腐败，在气调或真空包装的肉类食品中十分常见。棉子糖乳球菌（）是真空和气调包装鲶鱼的优势腐败菌之一，也可造成鲫鱼、牡蛎等冷藏水产品腐败。本研究可确定乳球菌属是海藻酸钠覆膜革胡子鲶鱼肉的主要腐败微生物，但具体腐败菌株需进一步分析验证。

4 结 论

海藻酸钠可食性膜覆膜革胡子鲶鱼肉的微生物数量、TVB-N含量、TBARs值、尸胺、腐胺、酪胺含量在冷藏过程中显著升高，腐败时优势菌在科水平上为链球菌科、肠杆菌科和希瓦氏菌科，在属水平上为乳球菌属、邻单胞菌属、摩根氏菌属和希瓦氏菌属。乳球菌属与鱼肉腐败指标呈显著正相关性，是革胡子鲶鱼肉优势腐败菌。