霍山铁皮石斛糖蛋白提取方法对比研究

祝启张 刘莉彬 崔绍进 刘庆慧 宁克壮 陈文正 张宁磊 邓辉

摘 要：为研究霍山铁皮石斛糖蛋白的功效，以霍山铁皮石斛鲜茎为试验材料，比较盐溶液浸提和水提醇沉2种方法提取糖蛋白的效果。盐（NaCl）溶液浸提条件为：提取温度4℃、浓度0.3mol/L、料液比1∶16、提取时间24h，提取液经硫酸铵分级（15%、35%、60%）沉淀，去离子水透析脱盐后，再经聚乙二醇浓缩得糖蛋白提取液。水提醇沉提取条件：65℃水浴浸提，浸提3次，每次3h，对铁皮石斛进行浸提得提取液，加不同浓度（50%、70%、90%）乙醇进行沉淀得糖蛋白粗品，经去离子水复溶得糖蛋白溶液。2种方法所得的提取产物用SDS-PAGE电泳，再经蛋白染色和糖染色，确定并对比糖蛋白条带。结果表明：盐溶液浸提法获得的糖蛋白条带在浓度、数量和分子量范围上都显著高于水提醇沉法。试验结果为进一步开展霍山铁皮石斛糖蛋白的活性研究奠定了基础。

关键词：霍山铁皮石斛;糖蛋白;提取方法

中图分类号 TS201.4 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2022）02-0024-03

Abstract： For the study of Mount Holyoke Dendrobium glycoprotein efficacy experiment on Mount Holyoke Dendrobium as experimental materials， according to the glycoprotein extraction effect， comparative study of “salt leaching glycoprotein” and “water extraction and alcohol precipitation of glycoprotein” two methods. Salt （NaCl） solution extraction conditions： extraction temperature of 4 DEG C， the concentration of 0.3mol/L， solid-liquid ratio 1∶16， extraction time 24h， extract by ammonium sulfate （15%， 35%， 60%） precipitation， deionized water purified by polyethylene glycol， concentrating glycoprotein extract. Water extract alcohol extraction conditions： 65 DEG C water bath extraction， extraction three times， each time 3h， extract of Dendrobium officinale extract liquid with different concentrations （50%， 70%， 90%） ethanol precipitated crude glycoprotein， dissolved by deionized water to glycoprotein solution. The products were identified by 12%SDS-PAGE electrophoresis， and then stained and stained with glucose to determine and compare the glycoprotein bands. The results showed that the number and concentration of the glycoprotein bands obtained by salt solution extraction method were significantly higher than that of water extraction and alcohol precipitation method. The experimental results provide a basis for further research work activity of Dendrobium candidum glycoprotein in Mount Holyoke.

Key words： Mount Holyoke Dendrobium; Glycoprotein; Extraction method

霍山铁皮石斛具有调节免疫、降血糖、抗肿瘤、降血脂、抗氧化等多种生物活性。植物糖蛋白是一类由寡糖链与肽链中以糖苷键共价连接而成的蛋白质，具有调节免疫、降血糖、抗肿瘤、降血脂、抗氧化等多种生理活性[1]。铁皮石斛中的石斛多糖具有较强的药理活性[2-5]。国内外学者对霍山铁皮石斛有效成分的系统研究有很多，但多数专家学者的研究侧重于总生物碱和多糖，而对于霍山铁皮石斛糖蛋白的活性研究却很少。糖蛋白在生物体内分布广泛，是目前人类研究比较多的一种糖复合物。大部分天然蛋白质都带有共价键相连的多糖侧链，并且因其多种生理活性而在生物体中起着重要作用。若能分离鉴定出霍山铁皮石斛的糖蛋白成分，就能为霍山铁皮石斛糖蛋白的分离鉴定及其免疫调节活性的研究提供基础数据，進而能进一步了解霍山铁皮石斛的药理药效的基础[6]。为此，本试验根据糖蛋白的性质，设计了提取蛋白的盐溶液浸法和提取多糖的水提醇沉法的2种糖蛋白提取方法，旨在探究2种提取方法提取霍山铁皮石斛糖蛋白的效果。

1 材料与方法

1.1 仪器设备 电子天平（GL-20G-II，上海安亭科学仪器厂），电泳仪（北京白晶生物技术有限公司），海尔冰柜，ST 16R型高速冷冻离心机（Thermo Fisher Scientific），电泳仪（北京白晶生物技术有限公司），水浴锅，磁力搅拌器，移液枪，摇床等。

1.2 材料和试剂

1.2.1 试验材料 霍山铁皮石斛、蛋白Marker、离心管。

1.2.2 试验试剂与配制 （1）SDS-PAGE试剂配制：①30%丙烯酰胺：28g丙烯酰胺，1g N，N-亚双丙烯酰胺蒸馏水定容至100mL。②分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris-HCl（pH8.8），18.15g Tris，HCl（市售浓度为11.6mol/L）2.2mL蒸馏水定容至100mL。③浓缩胶缓冲液：1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8），12.1g Tris，HCl（市售浓度为11.6mol/L）调至pH6.8，HCl用量超过7.88mL，蒸馏水定容至100mL。④10%SDS：10g SDS用蒸馏水定容至100mL。⑤10%过硫酸铵：1g过硫酸铵加10mL水。⑥TEMED（用纯品）。⑦电泳缓冲液（5×buffer）：15.1g Tris，72g Gly，5g SDS，定容至1000mL。⑧2×SDS-PAGE上样缓冲液：1.0mol/L Tris-HCl pH6.8 10mL，巯基乙醇1.39mL，SDS 4g，溴酚蓝0.2g，甘油20mL，定容止100mL。

（2）考馬斯亮蓝染色试剂配制：①染色液：考马斯亮蓝R250 0.25g，甲醇45mL，冰醋酸10mL，ddH2O 45mL。②脱色液：225mL乙醇，35mL乙酸加蒸馏水定容至500mL。

（3）PSA染色试剂配制：①PAS染色液：Schiff试剂，先将100mL蒸馏水煮沸，然后加入0.5g碱性品红，充分搅拌，必要时可再煮沸5min，使之充分溶解。待溶液冷却至50℃时，过滤，向溶液中加入10mL 1mol/L HCl。冷却至25℃时。加0.5g偏重亚硫酸钠（Na2S2O5）盖严，至于暗处，经几天后红色稍褪，溶液呈白或淡黄色。如果仍有红色，可加活性炭0.25g摇1min，过滤，装入棕色瓶并外包黑纸，放入冰箱中备用。②脱色液：225mL乙醇，35mL乙酸加蒸馏水定容至500mL。③0.5%偏重亚硫酸钠：0.5g偏重亚硫酸钠蒸馏水定容到100mL。

1.3 试验方法与步骤

1.3.1 盐溶液浸提糖蛋白 精确称取10g新鲜霍山铁皮石斛茎，剪碎，用160mL 1.3mol/L的NaCl溶液放入4℃冰箱浸提，过夜→过滤取上清液，进行硫酸铵分级沉淀。称取26.24g硫酸铵缓慢加入（边加边搅拌）到上清液中，完全溶解，放入4℃冰箱，过夜→离心（4000r/min，40min），待离心结束，收集沉淀，向上清液中缓慢加入31.52g硫酸铵进行二级沉淀（边加边搅拌）溶解完全，4℃冰箱过夜→离心（4000r/min，40min），收集二级沉淀，向上清液中再加入38.72g硫酸铵（边加边搅拌）进行三级沉淀，不完全溶解，4℃冰箱过夜→离心（4000r/min，40min），收集三级沉淀→沉淀透析，取3个透析袋沸水煮10min，检漏，后分别将一级、二级、三级所得到的粗糖蛋白提取液倒入3个透析袋中，两头扎紧，悬挂在装满去离子水的烧杯中，放到磁力搅拌器上进行透析，2h换1次水，换3次→浓缩，用聚乙二醇10000对透析袋中的糖蛋白提取液浓缩，浓缩30min，收集一、二、三级浓缩液到血清瓶中，贴好标签，即得盐溶液浸提糖蛋白提取浓缩液。

1.3.2 水提醇沉浸提糖蛋白[7-9] 精确称取3份10g新鲜霍山铁皮石斛茎，用剪刀剪成块茎，每块大概0.3cm即可，分别用洁净的纱布包好，放入烧杯中，向每个烧杯中加160mL蒸馏水，65℃水浴进行提取9h，分3次浸提，每次3h，提取结束后分别收集水提糖蛋白粗样液，向3份粗样液中分别加入50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇进行醇沉，醇沉4℃冰箱过夜→离心（4000r/min，40min）分别收集加入不同浓度乙醇所得到的沉淀，分别收集3份离心上清液再次加入相应浓度的乙醇进行醇沉，离心（4000r/min，40min）收集沉淀，将2次所得的沉淀倒在一起→去离子水复溶，分别收集3种浓缩液，即所得为水提醇沉糖蛋白提取浓缩液。

1.3.3 12%SDS-PAGE电泳[10] （1）搭胶板：制胶架玻璃板，将4块玻璃板洗净晾干，装到mini电泳架上，加底板，检漏，共2块胶板。（2）制胶：按照表1配制2倍的分离胶，TEMED加入后迅速将分离胶加入胶板，分离胶加至制胶架水平位置。缓慢加入蒸馏水少许水封30min。确定凝固后配制2倍的浓缩胶，将水全部倒掉加浓缩胶至玻板口，然后加梳子。待浓缩胶凝固拔出梳子，拆去底板，将mini电泳架放到电泳槽内，加500mL稀释后的SDS电泳缓冲液。

（3）加样：取6个eppendorf离心管，分别向6个离心管内加入50μL 2×SDS-PAGE上样缓冲液，再分别加入100μL的一级沉淀样液、二级沉淀样液、三级沉淀样液以及50%乙醇醇沉样液、70%乙醇醇沉样液、90%乙醇醇沉样液。煮沸5～10min，12000r/min离心1min，用移液枪加样，蛋白Marker第1个加样槽内加10μL，提取浓缩液每个加样槽内加20～40μL，共2块胶板（蛋白Marker是小量分装，避免了反复冻融，如长期贮存后使用，使用前最好取分装后的小管沸水浴预热3～5min后再上样电泳）。

（4）电泳：接好正负极，打开电源，开始电压设为75V，待样品进入分离胶后改为120V，电泳时间2.5h左右。待溴酚蓝条带迁移至下端1～1.5cm时停止电泳。

（5）剥胶、染色与脱色：取下2块胶板，去除玻璃板，每块胶都从中间切开，50%考马斯亮蓝染色，50%PAS染色，染色15min，染色结束后将染色液回收，用水稍微冲洗，加脱色液脱色，1h换一次脱色液，至背景清晰。

（6）PAS染色：将电泳结束后的胶用Schiff试剂染色15min后，用脱色液脱色1h，最后用0.5%偏重亚硫酸钠溶液漂洗，至出现粉红色条带。

2 结果与分析

2.1 盐提糖蛋白电泳结果 盐溶液浸提物电泳结果见图1，浸提物电泳后分别平行进行了考马斯亮蓝染色和PAS染色。

2.2 水提醇沉提糖蛋白电泳结果 水提醇沉糖蛋白电泳结果见图2，水提醇沉产物电泳后分别平行进行了考马斯亮蓝染色和PAS染色。

2.3 电泳结果分析 由表2可知，一级样液中的蛋白分子分布在31～97.4kDa，共有8条带，多糖分子分布在31～66.2kDa，共有5条带。二级样液中的蛋白分子分布31～66.2kDa和14.4kDa处，共5条带，多糖分子在31～66.2kDa和14.4kDa处，共6条带。三级样液中的蛋白分子分布在31～66.2kDa共3条带，多糖分子31～66.2kDa，共3条带。

由表3水提醇沉浸提糖蛋电泳条带结果可以看出，50%乙醇醇沉样液，70%醇沉样液，90%醇沉样液中的蛋白分子都分布在43～66.2kDa，各有2条带，多糖分子也分布在43～66.2kDa，同样各有2条带，与盐提产物染色条带的结果对应。

3 结论

经12%SDS-PAGE电泳图来看，盐提糖蛋白方法无论是提取蛋白还是提取多糖，其提取效果均优于水提糖蛋白方法。从提取的蛋白及多糖的种类分析，盐提糖蛋白法也优于水提糖蛋白法。

参考文献

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[10]郭尧君.蛋白质电泳实验技术[M].2版.北京：科学出版社，2005（9）：2. （责编：张宏民）