组合蛋白酶对肉仔鸡采食偏好性、血清生化指标和肠道组织形态的影响

王鑫鑫 李茜茜 吕 毅 马文锋 武晓红 赵芙蓉

(河南科技大学动物科技学院，洛阳 471023)

豆粕是动物饲粮中蛋白质的主要来源。我国是蛋白质资源相对短缺的国家，豆粕的对外依存度也随着畜牧业的发展大大增加，2017年我国大豆进口量高达9 554万t。同时，我国肉鸡养殖主要是以玉米-豆粕型饲粮为代表的高蛋白质饲粮，这虽然保证了肉仔鸡快速生长，但也造成了氮的过量排放和蛋白质资源的浪费。因此，如何合理利用蛋白质、减少资源浪费成为研究的热点[1]。在畜禽养殖中，动物自身不能完全消化饲粮中的蛋白质，而未消化的蛋白质会作为单胃动物肠道微生物的发酵底物导致动物消化紊乱[2]。研究表明，蛋白酶作为饲料添加剂可以有效地提高饲粮蛋白质的利用效率，从而改善动物采食[3]。外源蛋白酶可以补充幼龄动物内源酶分泌的不足，提高蛋白质的消化吸收，降低肠道吸收蛋白质的压力[4]。蛋白质水平对鸡的采食行为有着重要的影响[5]。研究还表明，蛋白酶对鸡的血液生化指标存在显著影响[6-7]。除此之外，侯振平等[8]研究表明，蛋白酶对动物的肠道健康存在积极影响，可以改善鸡的肠道形态。由此可见，蛋白酶可以提高动物对蛋白质的消化吸收，提高蛋白质利用率，对肉鸡福利起到积极作用的同时避免蛋白质资源浪费。为了进一步验证组合蛋白酶在肉鸡饲粮中的添加效果，本试验以爱拔益加(AA)肉仔鸡作为研究对象，探讨组合蛋白酶对肉仔鸡采食偏好性、血清生化指标和肠道组织形态的影响，从而为组合蛋白酶的合理利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用组合蛋白酶从市场上购得，为碱性蛋白酶，呈粉状固体，酶活性为251 852 U/g。试验采用玉米-豆粕型基础饲粮，参照《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)配制，其组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) %

1.2 试验设计

1.2.1 试验1

选择1日龄体况相近、健康的AA肉仔鸡40只，随机分为4个处理，每个处理10只鸡，每个处理的肉鸡单独饲养于同一笼中。采用自由选择试验法，同时为4个处理的肉鸡饲喂基础饲粮(饲粮Ⅰ)以及在基础饲粮中分别添加4(饲粮Ⅱ)、8(饲粮Ⅲ)和12 U/g(饲粮Ⅳ)组合蛋白酶的饲粮。试验鸡自由采食和饮水，试验期42 d。

1.2.2 试验2

采用单因素完全随机试验设计，选择1日龄体况相近、健康的AA肉仔鸡240只，随机分为4个组，每组6个重复，每个重复10只鸡。对照组(Ⅰ组)饲喂基础饲粮，试验组(Ⅱ～Ⅳ组)分别饲喂在基础饲粮中添加4、8和12 U/g组合蛋白酶的饲粮。试验鸡自由采食和饮水，试验期42 d。

1.3 饲养管理

试验在河南科技大学牧场进行，肉仔鸡均饲养在规格相同的笼内，饲养密度为10 只/m2。人工控制舍内温度，仔鸡1～3日龄时，舍内温度控制不低于35 ℃；4～7日龄时舍内温度控制在32～33 ℃；自第2周开始，每周降低3 ℃左右，直至保持在22～24 ℃为止。同时，保证舍内相对湿度维持在50%左右。鸡舍采用16 h光照和8 h黑暗的光照制度，自然通风与机械通风相结合，定期打扫鸡舍卫生[9]。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 采食偏好性

试验1中，试验鸡于每周的最后1天测定饲粮的耗料量，同时使用小蚁智能摄像机(夜视版)对其进行24 h连续拍摄记录，试验录像在计算机上转换后使用The Observer XT 12行为分析软件(Noldus，荷兰)进行连续采样和瞬时采样分析。采用连续采样法分析肉仔鸡对4种饲粮的采食行为发生的总采食时间、每顿采食时间以及采食次数；采用瞬时采样法，每隔30 min进行1次采样，分析每种饲粮的采食鸡只数，计算4种饲粮的采食百分比。

1.4.2 血清生化指标

试验2中，于21和42日龄时，每个重复随机选取2只鸡，采用翅下静脉采血法进行采血，每只鸡采5 mL，分离血清，采用全自动生化分析仪(东芝TBA-2000FR，日本)测定血清中葡萄糖(GLU)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、三碘甲状腺原氨酸(T3)和甲状腺素(T4)含量以及谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)活性。

1.4.3 肠道组织形态

于试验第42天09:00开始，从试验2每个重复随机选取2只试验鸡进行屠宰，打开腹腔，分离出十二指肠、空肠和回肠，每段肠段取2 cm，用生理盐水冲掉内容物，浸入4%的多聚甲醛溶液中常温保存，以制备石蜡切片。肠道组织经脱水、浸蜡、包埋、切片和苏木精-伊红染色后，在显微镜下观察拍照，使用Case Viewer软件分析测量小肠绒毛高度和隐窝深度并计算绒毛高度/隐窝深度(V/C)值。

1.5 数据处理和分析

试验数据通过Excel 2016初步统计后，使用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Duncan氏法进行多重比较，P<0.05表示差异显著，结果以“平均值±标准差”表示。

2 结 果

2.1 组合蛋白酶对肉仔鸡采食偏好性的影响

由表2可知，1～21日龄，各处理肉仔鸡对不同饲粮的耗料量之间无显著差异(P>0.05)；与饲粮Ⅰ相比，肉仔鸡对饲粮Ⅱ、饲粮Ⅲ和饲粮Ⅳ的采食次数、总采食时间和每顿采食时间也均无显著差异(P>0.05)。22～42日龄，虽然耗料量随着肉仔鸡的生长而增加，各处理肉仔鸡对不同饲粮的耗料量之间仍无显著差异(P>0.05)；且与饲粮Ⅰ相比，肉仔鸡对饲粮Ⅱ、饲粮Ⅲ和饲粮Ⅳ的采食次数、总采食时间和每顿采食时间也均无显著差异(P>0.05)。

表2 组合蛋白酶对肉仔鸡采食偏好性的影响Table 2 Effects of combinatorial protease on feed intake preference of broilers

续表2项目 Items饲粮 DietsⅠⅡⅢⅣ总采食时间 Total feed intake time/[min/(只·d)]105.56±12.48115.78±14.42105.72±18.07106.89±13.1322～42日龄 22 to 42 days of age耗料量 Feed consumption/[g/(只·d)]192.22±41.01202.22±36.50213.89±41.21207.22±37.68采食次数 Feed intake times/[次/(只·d)]8.67±0.978.33±0.978.44±0.988.28±0.89每顿采食时间 Feed intake time per meal/[min/(只·d)]18.87±2.8019.67±2.6619.42±2.7919.79±2.26总采食时间 Total feed intake time/[min/(只·d)]110.17±16.39116.06±15.67107.78±15.48112.39±12.83

由图1可知，1～21日龄，各处理肉仔鸡对4种饲粮的采食百分比分别为23.4%、23.4%、25.3%和27.9%，各处理间无显著差异(P>0.05)。22～42日龄，各处理肉仔鸡对4种饲粮的采食百分比分别为22.6%、32.1%、23.3%和22.0%，其中处理Ⅱ的采食百分比显著高于其他3个处理(P<0.05)。1～42日龄，各处理肉仔鸡对4种饲粮的采食百分比之间虽无显著差异(P>0.05)，但处理Ⅱ达到27.8%，比处理Ⅰ、处理Ⅲ和处理Ⅳ更高(分别为23.0%、24.3%和24.9%)。

数据柱标注无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。Data columns with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.图1 组合蛋白酶对肉仔鸡采食百分比的影响Fig.1 Effects of combinatorial protease on feed intake percentage of broilers

2.2 组合蛋白酶对肉仔鸡血清生化指标的影响

由表3可知，21日龄时，各组肉仔鸡血清ALB、T3和T4含量以及ALT、AST和ALP活性之间均无显著差异(P>0.05)；Ⅳ组血清TP、GLB、TC、HDL-C和LDL-C含量最高，其中血清TP、GLB和HDL-C含量显著高于Ⅰ组(P<0.05)，血清TC和LDL-C显著高于其他各组(P<0.05)；Ⅰ组血清GLU含量最高，显著高于其他各组(P<0.05)。

表3 组合蛋白酶对21日龄肉仔鸡血清生化指标的影响Table 3 Effects of combinatorial protease on serum biochemical indices of broilers at 21 days of age

由表4可知，42日龄时，各组肉仔鸡血清GLU、ALB、TC、TG、HDL-C、LDL-C和T3含量以及ALT、AST和ALP活性之间均无显著差异(P>0.05)；Ⅲ组血清TP和GLB含量最高，显著高于其他各组(P<0.05)；Ⅲ组血清T4含量最低，显著低于Ⅰ组(P<0.05)。

表4 组合蛋白酶对42日龄肉仔鸡血清生化指标的影响Table 4 Effects of combinatorial protease on serum biochemical indices of broilers at 42 days of age

2.3 组合蛋白酶对肉仔鸡肠道组织形态的影响

由表5可知，Ⅱ组和Ⅲ组肉仔鸡回肠绒毛高度显著低于Ⅰ组(P<0.05)；Ⅲ组回肠隐窝深度最低，显著低于Ⅰ组(P<0.05)；各组回肠V/C值无显著差异(P>0.05)。Ⅲ组和Ⅳ组肉仔鸡空肠隐窝深度显著高于Ⅰ组(P<0.05)，空肠V/C值也显著低于Ⅰ组(P<0.05)。Ⅱ组肉仔鸡十二指肠隐窝深度最低，但与Ⅰ组相比差异不显著(P>0.05)；Ⅱ组十二指肠V/C值最高，显著高于Ⅰ组和Ⅲ组(P<0.05)。

表5 组合蛋白酶对肉仔鸡肠道组织形态的影响Table 5 Effects of combinatorial protease on intestinal tissue morphology of broilers

3 讨 论

3.1 组合蛋白酶对肉仔鸡采食偏好性的影响

食物偏好是指有多种食物可选择时，动物更多地选择某一种食物，如虎、狮等在捕获猎物后，大都先猎食动物的内脏。动物对各种饲粮的选择和采食行为反映着动物的食物偏好，即采食偏好。研究表明，饲粮蛋白质水平会对肉仔鸡采食行为产生影响，随着饲粮蛋白质水平的提高，肉仔鸡采食行为占比显著降低，趴卧行为占比显著提高[5，10]。蛋白酶具有提高蛋白质利用率的作用，然而本研究中各处理肉仔鸡对不同饲粮在耗料量、采食次数、每顿采食时间及总采食时间上均未表现出显著差异，这与其他研究结果不同。产生这种不同的原因可能是本试验为肉仔鸡提供了高蛋白质饲粮，无法体现出动物在缺乏蛋白质状态下的表现。而本研究中，肉仔鸡生长后期(22～42日龄)采食添加4 U/g组合蛋白酶饲粮的采食百分比显著高于其他饲粮，明显表现出对该饲粮的偏好，产生这种差别的原因可能是肉仔鸡不同生长时期对饲粮的偏好不同，具体原因有待进一步试验研究。

3.2 组合蛋白酶对肉仔鸡血清生化指标的影响

动物机体血液生化指标的变化是反映动物代谢的直观表现[11-12]。血液中的GLU、TP和ALB是反映机体蛋白质利用率的重要指标，GLB是反映机体免疫的重要指标，TC和TG是机体脂类代谢的重要指标；ALT和AST参与脂类和蛋白质代谢，是反映肝脏和心脏功能的重要指标[13-16]。侯振平等[17]研究发现，饲粮添加蛋白酶对21日龄肉仔鸡血清GLU、TP、ALB、GLB、TC和TG含量均无显著影响。本研究中，饲粮添加组合蛋白酶对21日龄肉仔鸡血清ALB含量无显著影响，这与上述研究结果一致；但饲粮添加组合蛋白酶对21日龄肉仔鸡血清GLU、TP、GLB、TC和TG均表现出显著影响，其中Ⅳ组血清TP、GLB和TC含量显著高于Ⅰ组，原因可能是高剂量的组合蛋白酶更有利于水解蛋白质，从而提高蛋白质利用率。42日龄时，试验组肉仔鸡血清GLU、ALB、TC和TG含量等与对照相相比均无显著差异，可能是由于随着肉仔鸡的生长发育，组合蛋白酶对其吸收营养物质的影响逐渐降低。李东东[7]研究发现，不同蛋白质水平饲粮添加外源蛋白酶对肉仔鸡血清ALT和AST活性无显著影响，本研究与之结果一致。T3和T4统称为甲状腺激素，可以有效反映机体的代谢变化和应激程度，以此反映动物福利状况[18]。本试验中，21日龄时，饲粮添加组合蛋白酶对肉仔鸡血清T3和T4含量无显著影响；42日龄时，与对照组相比，Ⅲ组血清T4含量虽然显著降低，但血清T3含量无显著差异，而T4在外周血液中，只有转化成T3才能发挥其生物学效应，因此组合蛋白酶对肉仔鸡机体代谢和应激并未产生显著影响。

3.3 组合蛋白酶对肉仔鸡肠道组织形态的影响

肠道是吸收各种营养物质的主要器官之一，小肠绒毛是吸收各种营养物质的主要场所。小肠结构和功能的完整性影响着营养物质的消化、吸收和转运，其中小肠绒毛高度和隐窝深度与肠道生理相关，也是衡量肠道功能的重要指标[19]。小肠绒毛高度与吸收效率有关，绒毛高度增加会增加肠黏膜与食糜接触的表面积，有利于营养物质的吸收；隐窝深度反映了细胞增殖的速率，隐窝深度变浅表明肠道上皮细胞成熟率上升，肠黏膜上皮绒毛吸收能力增强[20]；而V/C值可以用来反映肠道吸收效率，V/C值升高则肠道吸收营养物质的速率加快，反之则降低。

研究表明，适量酶制剂能提高肉仔鸡小肠绒毛高度，过量反而不利于肉仔鸡肠道发育[21-23]。本研究中，Ⅱ组肉仔鸡空肠和十二指肠隐窝深度显著低于Ⅲ组，空肠和十二指肠V/C值显著高于Ⅲ组；Ⅳ组空肠隐窝深度显著高于Ⅰ组，空肠V/C值显著低于Ⅰ组。以上结果表明，在饲粮中添加适量的组合蛋白酶有利于改善肉仔鸡肠道组织形态，过量的蛋白酶反而不利于肠道发育，这与周梁[22]的研究结果一致。由此可见，在饲粮中添加适量的组合蛋白酶有利于改善肉仔鸡肠道组织形态。不过，本研究中，Ⅰ组肉仔鸡回肠绒毛高度显著高于Ⅱ组和Ⅲ组，组合蛋白酶反而抑制了回肠绒毛高度，这可能与蛋白酶到达回肠时活性降低有关。关于组合蛋白酶的最适添加量及其影响机制仍需进一步试验研究。

4 结 论

① 肉仔鸡仅在其生长后期(22～42日龄)对添加4 U/g组合蛋白酶的饲粮表现出采食偏好性。

② 饲粮添加12 U/g组合蛋白酶显著提高了21日龄肉仔鸡血清TP、GLB、TC、HDL-C和LDL-C含量，改善了机体脂类合成，增强了肉仔鸡免疫力；饲粮添加8 U/g组合蛋白酶显著提高了42日龄肉仔鸡血清TP和GLB含量。

③ 饲粮添加4 U/g组合蛋白酶可以提高或维持肉仔鸡十二指肠和空肠V/C值，改善肉仔鸡肠道组织形态。

④ 综合考量，本试验中组合蛋白酶的适宜添加量为8 U/g。