天疱疮主要自身抗体及其检测临床意义研究进展

王麒钧，朱海琴，潘 萌

（上海交通大学医学院附属瑞金医院皮肤科，上海 200025）

天疱疮是一组由自身抗体介导的表皮内自身免疫性大疱病的统称，包括寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、副肿瘤型天疱疮、IgA 型天疱疮及疱疹样天疱疮等类型。天疱疮患者的主要临床表现为黏膜以及皮肤的水疱糜烂，严重影响患者的生存质量，重者可危及生命。天疱疮属罕见病，其中最为常见的类型是寻常型天疱疮，其发病率为每年（0.1～0.5）例/10 万人。天疱疮多发生于成人，平均发病年龄为40～60岁。在普遍应用全身性免疫抑制剂治疗前，该病患者的5 年生存率不足30%，患者往往死于体液蛋白流失、进食受限导致的电解质失衡、营养不良等。

1963年，Beutner 及Jordon 等首先应用免疫荧光技术发现了天疱疮患者血清中的自身抗体。此后，随着免疫印迹及免疫沉淀检测技术的应用，明确了抗Dsg1、Dsg3 抗体是天疱疮的主要自身抗体类型，并且为直接致病作用。以上研究结果证明天疱疮是一种自身抗体介导的单器官免疫疾病，而抗Dsg1、Dsg3 抗体检测在疾病的诊断及治疗中起到较为重要的作用。近年来，随着分子生物学及生物信息学的发展，越来越多新的自身抗体被发现，并被证实在天疱疮的致病过程中起到了协同作用，进一步完善了天疱疮的致病机制研究。本文回顾近年国内外相关文献，对天疱疮患者外周血中发现的自身抗体及作用机制及其在疾病诊断、治疗监测中的研究新进展作一综述，为天疱疮自身抗体的基础及临床研究提供参考。

天疱疮主要自身抗体及作用机制

天疱疮的自身抗体主要存在于患者皮损部位及外周血中，包括抗桥粒芯蛋白抗体、抗桥粒胶蛋白抗体、抗斑蛋白家族抗体及抗乙酰胆碱抗体等，这些抗体之间相互协同，作用于表皮细胞间的黏附分子，使其产生功能障碍，进而导致表皮棘细胞层结构松解形成水疱、大疱。基于以上致病过程，近年对于抗体作用机制的研究主要聚焦于引发棘层松解的抗体种类及其介导的信号通路。

一、抗桥粒芯蛋白（desmogelin，Dsg）抗体

Dsg 是一类钙黏素，其与其他钙黏素同属于钙依赖性细胞黏附分子家族，共同形成和维持组织的完整性。Dsg 属于桥粒钙黏素的一种，有4 种异构体（Dsg1～Dsg 4），而Dsg1 和Dsg3 这2 种亚型基本仅表达于复层鳞状上皮，是天疱疮致病的主要靶抗原。

1.抗体亚型：抗Dsg3 抗体是寻常型天疱疮的标志性抗体，其抗体亚型主要有IgG、IgA 及IgE 型；抗Dsg1 抗体则是落叶型天疱疮的标志性抗体，其抗体亚型主要有IgG、IgA[1]，上述2 种抗体均存在于患者的外周血及皮损中。关于IgG 抗体亚型的研究结果多表明，天疱疮患者在疾病活动期时体内的IgG 抗体亚型以IgG4 亚型为主，而在缓解期时则以IgG1 亚型为主，且其IgG4 与IgG1 抗体比值与其疾病活动性在一定程度上呈正相关，但IgG1 及IgG4 抗体均可参与致病，且致病性类似[2-3]。近年也有研究提示，IgG3 亚型抗体在天疱疮的疾病进展过程中也存在一定作用[4]。IgA 型抗体多见于IgA 型天疱疮患者；抗Dsg3 的IgE 型抗体也可见于一部分的寻常型天疱疮患者[5]。

2.作用机制：抗Dsg 抗体识别的主要抗原表位位于Dsg结构的N端，当抗Dsg 抗体与Dsg 结合后，主要通过以下两方面起作用，促使水疱形成[6-7]。①抗原抗体结合后产生空间位阻效应，抑制钙黏素的同嗜和异嗜性黏附，丧失黏附效应。既往研究提示，抗Dsg3 抗体能够抑制Dsg3 的同嗜性黏附，而抗Dsg1 抗体则无明显的抑制同嗜作用。Ishii 等[8]采用微珠包裹重组人抗原的方法，证明抗Dsg1、Dsg3 抗体无需经过细胞信号转导就可分别抑制Dsg1/桥粒胶蛋白（desmocollins，Dsc）1、Dsg3/Dsc3 的异嗜性相互作用，进而导致细胞间产生空间位阻效应，促进细胞解离。②抗Dsg 抗体与Dsg结合引发信号转导，主要包括Ca2+、p38MAPK、磷脂酶C/蛋白激酶C、表皮生长因子受体等多条信号通路，导致细胞间黏附功能紊乱。近年研究提示，磷脂酶C 介导的Ca2+内流可能是天疱疮发病过程中最早的事件[9]。抗Dsg1 抗体结合Dsg1 后能够激活磷酸肌醇14-激酶α，进而激活磷脂酶C-γ1，产生三磷酸肌醇，与位于内质网的三磷酸肌醇受体结合，进而引起Ca2+内流，而蛋白激酶C 也是Ca2+通路下游的主要作用靶点之一。生理状况下，Dsg3 与桥斑珠蛋白结合后可抑制p38MAPK，而当Dsg3 与自身抗体结合后，可产生空间位阻效应，从而导致其细胞黏附功能丧失，进而激活p38MAPK，促进Dsg3 的内化及角蛋白的回缩[10]。抗Dsg3 抗体与Dsg3 结合还能够通过Ca2+途径及Src 途径激活表皮生长因子受体，进而参与斑珠蛋白磷酸化、激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 和9 等天疱疮致病途径[11-12]。

二、抗Dsc 抗体

Dsc 与Dsg 类似，也属于Ca2+依赖性钙黏蛋白家族中的一种，两者成对存在，参与组成细胞间的桥粒结构，为相邻的上皮细胞提供黏附作用。Dsc 共有3 种异构体（Dsc1～Dsc3），陆续有报道在副肿瘤型天疱疮、寻常型天疱疮、落叶型天疱疮及疱疹样天疱疮患者中发现了IgG 型的抗Dsc 抗体（包括Dsc1～Dsc3）。抗Dsc 抗体在落叶型、寻常型天疱疮患者外周血中阳性率高低不一（0～44%），而在PVe、副肿瘤型天疱疮、疱疹样天疱疮等少见类型天疱疮患者的外周血抗Dsc 抗体阳性率（40%～67%）更高[13-14]。

抗Dsc 抗体的病理效应过程也一直受到研究人员关注，其中抗Dsc3 抗体的致病性已被学界普遍认可。Chen 等[15]发现，Dsc3 基因缺失的小鼠会产生水疱糜烂。体外实验也证实，IgG 型抗Dsc3 抗体能够单独造成细胞黏附功能丧失及棘层松解。但抗Dsc3 抗体导致天疱疮的具体分子机制目前尚未完全阐明，推测其可能是通过空间位阻效应致病，即分子彼此接近时引起空间阻碍作用；或是通过特异性识别结合EC2 结构阈中的钙依赖性抗原决定簇，从而耗竭Dsc3 结构，导致细胞黏附功能丧失、棘层细胞松解；或同时存在与其他少见自身抗体的协同致病作用[16]。

三、抗斑蛋白家族抗体

斑蛋白家族包括桥斑蛋白、网蛋白、大疱性类天疱疮抗原1、包斑蛋白、周斑蛋白及epiplakin等，是一组具有多结构域的大分子蛋白。这些蛋白参与连接细胞骨架，形成复杂的连接结构。针对这一组抗原的抗体仅见于副肿瘤型天疱疮患者外周血及皮损中，其中抗包斑蛋白抗体和抗周斑蛋白抗体最为常见[17]。斑蛋白分子是一类胞质内抗原，在副肿瘤型天疱疮患者中最为常见（74.2%～80.6%），目前已作为其诊断标准之一纳入指南。以上这些抗体均为IgG 型抗体，并不能穿过细胞膜产生效应，故这一组抗体与天疱疮发病间的相关性尚不清楚。

四、抗乙酰胆碱受体抗体

在人的表皮内存在非神经元胆碱能系统，其在角质形成细胞间以及角质形成细胞与基质的连接黏附之间起到重要作用。抗乙酰胆碱受体抗体也是一组参与天疱疮致病过程的抗体，其中主要包括抗毒蕈碱样胆碱受体（Muscarinic acetylcholine receptor，mAChR）抗体、抗烟碱样胆碱受体抗体及抗Pemphaxin（PX）抗体[18]。

1.mAChR：mAChR 是一种跨膜糖蛋白，其包括5 种亚型（M1～M5）。早年体外实验发现，激活mAChR 能够逆转由天疱疮抗体引起的棘层细胞松解，提示乙酰胆碱受体受损可能是天疱疮病理过程中的一环。85%～100%的天疱疮患者血清中存在抗mAChR 抗体，其中又以抗M3 亚型抗体为主，其滴度与天疱疮疾病面积指数（pemphigus disease area index,PDAI）有着较好相关性（r=0.65,P<0.0001）。Chernyavsky 等[19]通过小鼠实验发现，抗M3 型mAChR 抗体的存在与棘层松解的严重程度相关，这是由于在生理情况下持续激动M3 型mAChR，能够保持基底细胞与基底膜之间的黏附作用。同时，该研究还发现，抗M3 型mAChR 抗体与抗hSPCA1（ATP2C1 编码的Ca2+/Mn2+ATP 酶）抗体在Dsg1、Dsg3 阴性天疱疮的致病过程中起到协同致病作用。

2.烟碱样胆碱受体：烟碱样胆碱受体是配体门控离子通道蛋白超家族的成员，其功能主要是介导Na+和Ca2+内流以及K+的外排。天疱疮患者体内的抗烟碱样胆碱受体抗体与线粒体外膜上的烟碱样胆碱受体结合，使线粒体的呼吸链发生变化，进而导致膜电位改变、H+渗漏，细胞内的活性氧浓度增加，Cyt C 异常释放，促进线粒体和整个细胞的凋亡，参与天疱疮的发病[20]。

3.Pemphaxin（PX）：PX 是一种相对分子质量为75 000的膜联蛋白，也被称为膜联蛋白31 或ANXA 9，其同时具有烟碱样及毒蕈碱样的双重药理作用，故被视为乙酰胆碱受体的一种。体外实验中，抗PX 抗体能够导致皮肤棘层松解。但在小鼠实验中，单独的抗PX 抗体及洗去抗PX 抗体的天疱疮抗体均不能产生相应的临床症状，提示天疱疮患者水疱的形成是由于多种抗体综合效应的结果[18]。

五、其他少见抗体

近年来，随着对天疱疮抗体的深入研究，还发现了一些天疱疮患者外周血相对较为少见的抗体，如抗α2巨球样蛋白1抗体、抗甲状腺过氧化物酶抗体、抗hSPCA1 抗体、抗E-钙黏素抗体、抗斑珠蛋白抗体、抗斑菲素蛋白抗体及抗高亲和力IgE 受体抗体，有部分研究提示这些少见抗体也在致病过程中起到协同作用，从侧面证明天疱疮是一类异质性疾病[18]。

天疱疮自身抗体的检测及临床意义

一、抗体检测

临床诊断天疱疮的依据主要由临床症状、组织病理学检查结果以及自身抗体检测结果三部分组成。作为一种主要由自身抗体介导的器官特异性自身免疫病，确定自身抗体的存在是确诊天疱疮不可或缺的条件。目前，检测天疱疮自身抗体的方法主要包括免疫荧光、酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA）、蛋白质印迹、化学发光免疫分析法等，用于诊断天疱疮的灵敏度及特异度见表1。在临床实践中，免疫荧光与ELISA 为较好的初筛方法，能够明确大部分患者的诊断，当无法明确诊断时，免疫印迹技术可作为有效的补充。而化学发光免疫分析法作为新的技术，尚未得到广泛应用，其灵敏度及特异度仍待进一步验证。

表1 临床常用抗体检测方法诊断天疱疮的灵敏度及特异度

1.免疫荧光法：免疫荧光法检测天疱疮自身抗体最早在临床诊疗中得到应用。临床上常用的免疫荧光检测方法分为直接免疫荧光及间接免疫荧光，2 种方法能够分别确定患者皮肤及外周血中是否存在针对皮肤的自身抗体、确定其自身抗体沉积于棘层细胞间或基底膜带，从而初步排除类天疱疮及其余非自身免疫性大疱病。直接免疫荧光结果显示，IgG 和（或）C3 在棘细胞间沉积是诊断天疱疮的金标准。猴食管作为底物的间接免疫荧光也能够很好地显示棘细胞间沉积的抗体，其是最早作为诊断标准纳入国内外临床指南。但在一些情况下（比如抗ABO 血型抗体干扰），免疫荧光法也可能出现不准确的结果[21]。而使用高表达斑蛋白家族的小鼠膀胱组织作为底物，则有助于明确副肿瘤型天疱疮（免疫学特征为产生抗斑蛋白自身抗体）的诊断[22]。

2.蛋白质印迹法检测：蛋白质印迹法（Western blotting）检测是一种经典的抗体鉴定方法，早年也常被用于天疱疮抗体的检测，但由于其步骤相对繁琐、实验时间较长，近年已不推荐用于临床检测[22]。现该方法多用于检测除抗Dsg1、Dsg3 抗体外的一些相对少见的自身抗体，如抗Dsc 抗体等，结合临床症状有助于提示诊断增殖型天疱疮、疱疹样天疱疮等少见类型的天疱疮。同时，蛋白质印迹法检测也是发现新的天疱疮抗原的重要方法。

3.ELISA：ELISA 由于能够区分特异性的自身抗体，并且能够定量检测，目前已被越来越多地被应用于天疱疮的临床诊断。现商用的ELISA 试剂盒可以检测针对Dsg1、Dsg3、envoplakin 和periplakin 的抗体，灵敏度和特异度均较高，检测过程也相对简便、快捷，能够较好地对寻常型天疱疮（仅抗Dsg3 抗体阳性或抗Dsg1、Dsg3 抗体双阳性）、落叶型天疱疮（仅抗Dsg1 抗体阳性）及副肿瘤型天疱疮（抗envoplakin、periplakin 抗体阳性）进行明确的分型诊断，与间接免疫荧光结果联合使用，能够避免后者可能产生的假阳性结果，进一步减少误诊。现国内外临床指南均已将ELISA 的阳性结果纳入天疱疮的诊断标准[23]。

4.其他检测技术：近年来还有一些新的检测技术，如BIOCHIP、化学发光酶免疫分析法等已被用于临床检验。BIOCHIP 是采用人工重组底物与传统底物结合组成的BIOCHIP 进行间接免疫荧光检测的方法，该方法能够同时检测多种底物，在兼具高效的同时，有较高的灵敏度和特异度[24]。化学发光酶免疫分析法是近年来一种检测特异性抗体的新方法，具有快速、自动和节约标本的优点，其结果与ELISA 结果间高度一致（在Dsg1，为96%，在Dsg3，为97%），但在抗原抗体孵育时间不足的情况下可能导致假阴性结果，故其用于临床诊断的可靠性仍需进一步行研究验证[25-26]。

二、抗体检测意义

1.判断病情：已有多个研究对ELISA 法测定的抗Dsg1、Dsg3 滴度与天疱疮疾病严重程度间的相关性进行了探索，但相关结论并不完全统一[27-28]。65%以上的研究提示，抗Dsg1、Dsg3 抗体与天疱疮疾病活动间存在正相关性（尤其抗Dsg1 抗体）[29]，但仍存在一部分临床缓解但抗体滴度较高的患者。目前有较多研究对这一问题进行了探讨，有研究表明，可能存在非致病性的抗非Ca2+依赖表位的抗Dsg3 抗体，故一部分临床缓解的患者其外周血抗Dsg3 抗体仍处于较高滴度，对抗Ca2+依赖表位抗Dsg 抗体的监测（使用EDTA处理样本）可能有助于临床医师更准确地监测患者的病情[30-32]。然而，缓解期抗体高滴度患者的外周血抗体仍能够使重组Dsg3-Dsc3 磁珠解离，证明其仍存在致病性[23]，故可能存在非致病性抗体以外的其他机制导致缓解期高滴度现象的出现。另有研究提示，特异性的抗体亚型比例可能与天疱疮疾病严重程度间具有一定程度的相关性，活动期患者外周血中以IgG4 抗体亚型为主[IgG4∶IgG1=（1.28～3）∶1]，稳定期患者外周血中则以IgG1 抗体亚型为主（IgG4∶IgG1=1∶7）[32]。除上述外，尚有研究提示毛囊荧光强度与天疱疮疾病活动度呈正相关（r=0.505，P<0.05），可考虑作为临床监测疾病活动度的工具[33]。

2.预测天疱疮复发：在预测天疱疮复发方面，Abasq 等[29]研究表明，ELISA 检测抗Dsg1 抗体≥20 U/mL 能够较好地预测皮肤复发（阳性预测值为79%，阴性预测值为84%）；而ELISA 检测抗Dsg3 抗体≥130 U/mL，能够较好地预测黏膜复发（阳性预测值为84%，阴性预测值为81%）。还有研究显示，抗Dsg3 抗体ELISA 及直接免疫荧光检测双阳性的稳定期寻常型天疱疮患者，平均无复发时间更长（28.6 个月比53.7 个月，P=0.015），但其单独检测预测复发的灵敏度（59%，61%）、阳性预测值（0.56，0.68）及阴性预测值（0.75，0.67）并不高[34]。

天疱疮患者初次诊断时，其抗体水平也可能影响其疾病复发的风险，诊断时仅Dsg3 抗体阳性的患者，在临床缓解时其抗体未转阴，是天疱疮复发的显著预测因子（OR=7.89，95%置信区间为2.06～30.21，P<0.01）；诊断时抗Dsg1、Dsg3 抗体双阳性的患者，在临床缓解时其Dsg1 抗体未转阴，也是天疱疮复发的显著预测因子（OR=5.74，95%置信区间为1.15～28.61，P=0.03）[35]。除上述研究外，还有个案报道显示，天疱疮患者的头皮毛囊及皮肤直接免疫荧光检测双阴性，可能提示着较低的疾病复发风险，但这一结论尚缺乏大样本研究验证[33]。

3.指导治疗：在大型临床试验RITUX3 证明了利妥昔单抗联合小剂量激素治疗的优越性后，近年来利妥昔单抗联合小剂量激素逐渐成为寻常型天疱疮患者的一线治疗方案。RITUX3 后续研究提示，治疗后PDAI≥45 和（或）第3 个月抗Dsg1 抗体滴度＞20 IU/mL 和（或）抗Dsg3 抗体滴度＞130 IU/mL 的患者，复发风险更高（灵敏度为91%，特异度为60%，阳性预测值为50%，阴性预测值为94%），这部分人群可能需要第6 个月重复给药治疗[36]。这也提示，在临近患者的治疗终点时，临床医师需要结合其自身抗体的检测结果来制定诊疗方案。

总结和展望

天疱疮作为一种自身抗体介导的慢性潜在致命性自身免疫疾病，对其自身抗体的研究及检测有助于揭示疾病的发病机制、准确评估患者的疾病活动度、指导临床用药。本文总结了天疱疮主要自身抗体在疾病中作用机制的研究进展，以及自身抗体检测在诊断、评估、监测等临床应用领域的探索发现。

未来对于天疱疮自身抗体致病机制进行更深入研究，能够进一步揭示天疱疮的具体病理机制及疾病进展过程，有助于寻找更加精准、有效的治疗靶点。同时，更多大样本、多中心的临床研究则有助于明确以及发现自身抗体检测在疾病监测方面的更多应用，指导临床诊疗。