北京地区一种菘蓝白粉病病原菌的鉴定△

王纾琪，刘燕敏，王蓉，丁万隆，李勇

中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193

菘蓝Isatis indigoticaFort.为十字花科菘蓝属草本药用植物，其干燥根为板蓝根，是我国常用大宗中药材[1]。板蓝根味苦，性寒，归心、胃经，具有清热解毒、凉血利咽等功效[2]。研究发现，其含多种抗菌、抗病毒成分，可增强机体免疫力[3]。以板蓝根为主要原料的复方板蓝根颗粒、板蓝根软胶囊等常用于治疗流行性感冒、流行性乙型脑炎、腮腺炎、肝炎等疾病[1,4]。菘蓝在我国河北、河南、安徽、陕西、甘肃、内蒙古、山东、浙江、黑龙江等省份均有大面积栽培，湖北、山西、辽宁、北京、上海、四川、新疆等地也有少量栽培[5]。人工栽培易受气候及栽培管理模式影响，根腐病、霜霉病、白粉病等在菘蓝各产区时有发生[6]。

2021 年8—10 月，北京地区降雨频繁，田间持续低温、高湿导致中国医学科学院药用植物研究所试验地种植的菘蓝暴发白粉病，平均发病率高达30%，对其生长及产量造成严重影响。查阅文献，仅发现关于新疆乌鲁木齐菘蓝白粉菌的形态描述[7]。我国各省份菘蓝产区虽然也有白粉病发生，但未见相关病原菌研究报道。不同地域种植的菘蓝白粉病菌是否一致目前尚不清楚。为此，笔者于2021 年采集菘蓝白粉病样品，结合形态学及分子生物学方法，对菘蓝白粉病病原进行鉴定，以期为菘蓝白粉病防控提供参考。

1 材料

1.1 病原菌样本

中国医学科学院药用植物研究所试验地（E116°16'41.30″，N40°2'5.52″）种植的1 年生菘蓝，经中国医学科学院药用植物研究所丁万隆研究员鉴定为菘蓝Isatis indigoticaFort.。2021 年10 月，在菘蓝白粉病叶片上收集白粉菌。采样前将无菌称量纸平铺于叶片下方，手指轻弹将叶片上附着的白粉菌振落，转入2 mL无菌离心管，备用。

1.2 仪器

XSP-12CA 型生物显微镜（上海光学仪器厂）；T100 型热循环聚合酶链式反应（PCR）扩增仪（Bio-Rad公司）；京N9548R型自动研磨机（北京赫得科技有限公司）；DYY-6C 型电泳仪（北京市六一仪器厂）。

1.3 试药

TaqDNA 聚合酶（日本TaKaRa 公司）；真菌基因组DNA 提取试剂盒（美国Omega 公司）；DNA凝胶回收试剂盒（北京汇天东方生物技术有限公司）；其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 田间症状观察

田间观察菘蓝白粉病的发病部位、发病规律及病斑颜色、大小、形状等。

2.2 病原菌形态特征观察

采用粘贴法[8]从新鲜病组织上粘取少量菌丝，无菌水作为浮载剂，显微镜下观察白粉菌的菌丝形态、产孢结构、分生孢子及其着生方式等，拍照记录。

2.3 病原菌分子鉴定

称取菘蓝白粉菌约0.1 g，液氮冷却条件下振荡研磨60 s，真菌基因组DNA 提取试剂盒提取白粉菌基因组DNA。引物内部转录间隔区1（ⅠTS1，5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）/PM6（5'-GYCRCYCTGTCGCGAG-3'）用于白粉菌rDNA-ⅠTS 区段扩增[9]。扩增体系25 μL，包括：5 U·μL-1TaqDNA聚合酶0.2 μL、10×PCR buffer（100 mmol·L-1Tris、500 mmol·L-1KCl、2 mmol·L-1Mg2+）2.5 μL、dNTP（2.5 mmol·L-1）1 μL、上下游引物（10 µmol·L-1）各1 μL、模板DNA（约20 ng·μL-1）3 μL、ddH2O 16.3 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶检测后，送北京擎科新业生物技术有限公司测序。经与GenBank 中同源序列进行Blast 比对，选取核酸序列一致性较高的菌株用MegaX 软件中的邻接法（NJ）构建系统发育进化树。用于检验支持率的重复抽样数为1000次。

3 结果

3.1 菘蓝白粉病田间症状

菘蓝白粉病易在持续高湿的多雨季节发生，每年7 月上旬至10 月上旬高发，多见于叶片及叶柄部位。白粉病自靠近地表的下层叶片开始侵染，然后自下层叶片向上层叶片传播。发病早期，菘蓝叶片正面出现多个不规则形褪绿病斑，中心浅褐色，外缘白色，病斑上菌丝稀疏，白色（图1A）；条件适宜时，菌丝放射状生长，相邻病斑相互融合，形成不规则形菌丝层（图1B）；末期，病株叶片布满白色粉状霉层，病叶变为褐色（图1C）；最终叶片干枯死亡（图1D）。

图1 菘蓝白粉病田间症状

3.2 病原菌形态特征

病菌菌丝直或略弯，宽5～7 μm，上有浅裂叶状附着胞（图2A）。分生孢子梗直立或微弯，不分枝，75～124 μm×8～14 μm，顶端串生分生孢子（图2B）。分生孢子长椭圆形或近圆柱形，34～47 μm×12～19 μm（图2C）。芽管在分生孢子近端处萌发，直或弯曲，芽管顶端有吸器（图2D）。无性世代形态特征与白粉菌目（Erysiphales）白粉菌科（Erysiphaceae）白粉菌属（Erysiphe）相关描述一致[10]。由于未发现该病原菌的有性世代，仅通过无性世代形态特征难以对该病菌进行准确鉴定，初步推测其可能属于白粉菌属。

图2 菘蓝白粉菌显微形态特征

3.3 病原菌rDNA ⅠTS序列分析

经白粉菌特异引物扩增，获得1 条长496 bp 的条带（GenBank登录号：OL884216）。Blast分析结果表明，菘蓝白粉菌特异引物扩增序列与十字花科白粉菌Erysiphe cruciferarum（GenBank 登录号分别为MT309701、MK341128、MF192845、KY660929）的序列同源性为100%。从美国国立生物技术信息中心（NCBⅠ）数据库选取同源性较高的序列构建系统发育树，供试菘蓝白粉菌与十字花科白粉菌聚在同一分枝，与其他白粉菌亲缘关系较远（图3）。结合对病菌形态鉴定的初步推测，最终将其鉴定为十字花科白粉菌。

图3 基于rDNA ITS序列构建的菘蓝白粉菌系统发育进化树

4 讨论

白粉病菌属于子囊菌门（Ascomycota）白粉菌目（Erysiphales）白粉菌科（Erysiphaceae），为高等植物专性寄生病原真菌。其家族成员众多，根据新分类系统，至少包括15 属650 余种[10-11]。白粉病菌的寄主范围、专化性、有性及无性阶段孢子及产孢结构的形态特征一直是白粉菌分类鉴定的重要依据[12-13]。然而，有时采集到的病菌仅有无性世代，这无疑给病菌鉴定工作带来困扰。分子生物学方法为解决该问题提供了新途径。真菌rDNA-ⅠTS 序列在真菌种内既有高度的保守性，又存在丰富的种属间变异。根据此特性，可利用专用引物扩增白粉菌基因组ⅠTS 区段，结合核酸序列同源性分析，将此作为白粉菌属病原分类鉴定的辅助参考依据[14-16]。

十字花科白粉菌寄主广泛，可侵染十字花科芸薹属芥菜Brassica juncea（L.）Czern.、雪里蕻B.junceavar.multicepsTsen et Lee、榨菜B.junceavar.tumidaTsen et Lee、甘蓝B.oleraceavar.capitataL.、卷 心 菜B.oleraceavar.capitataL.、油 菜B.campestrisL.、青菜B.chinensisL.、大头菜B.junceavar.megarrhizaTsen et Lee、白菜B.pekinensisRupr.、蔓菁B.rapaL.、芜菁B.rapaL.，独行菜属独行菜Lepidium apetalumWilld.、宽叶独行菜L.latifoliumL.、柱毛独行菜L.ruderaleL.，芝麻菜属芝麻菜Eruca vesicariasubsp.sativa（Mill.）Thell.、芸 芥E.vesicaria（L.）Cav.subsp.sativa（Mill）Thellung，诸葛菜属二月兰Orychophragmus violaceus（L.）O.E.Schulz，播娘蒿属播娘蒿Descurainia sophia（L.）Webb.ex Prantl、菘蓝属欧洲菘蓝Isatis tinctoriaL.等多种植物[17-25]。本研究发现，侵染北京地区菘蓝的白粉病菌为十字花科白粉菌，这与前人描述基本一致[7]。上述研究结果表明，除欧洲菘蓝外，菘蓝也是该病菌的一个重要寄主。

白粉病是板蓝根生产上的主要病害之一。每年环境条件适宜时，白粉病在产区大面积流行，给板蓝根生产造成较大危害。目前，化学杀菌剂仍是菘蓝白粉病防治的主要手段。由于杀菌剂滥用，菘蓝白粉病菌已对多种杀菌剂产生抗药性[26]。针对该问题，一方面应筛选高效低毒可替代的化学杀菌剂，严格控制杀菌剂的使用频次和剂量，以减缓病菌抗药性产生；另外，通过加强田间管理、合理密植及科学施肥、培育推广抗病品种等措施，结合生物防治、物理防治等手段，减少化学杀菌剂使用的同时，实现菘蓝白粉病害的早期预防和控制。