扶正散结方辅助治疗对晚期非小细胞肺癌患者免疫功能及microRNA-335-5p水平的影响*

刘峰林，马琳，宋然，黄焰

（徐州市中医院1.肿瘤科，2.呼吸内科，江苏 徐州221000）

肺癌是临床常见的恶性肿瘤之一，多发于男性，其发病率、致死率在男性肿瘤中居于首位[1]。肺癌按组织病理学分类又分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌（non-small cell lung carcinoma, NSCLC），其中NSCLC 在肺癌中占比> 80%[2]。NSCLC 早期症状隐匿，多数患者确诊时已发展至中晚期，发生远处转移，无法接受手术根治。相关数据显示，超过2/3 的NSCLC 患者无法接受手术根治[3]。对于此类患者临床多以放射治疗、化学治疗（以下简称化疗）作为主要治疗手段，但化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常机体造成较大损伤，且毒性反应较多。近年来，中医药在抗肿瘤研究方面取得较好成绩，尤其在减毒增效、抑制肿瘤生长等方面，可一定程度弥补放化疗的不足[4]。以往有研究指出，扶正散结方、扶正减毒汤、扶正抑瘤汤等用于肺癌的辅助治疗可有效提高临床疗效[5-6]。但多以早中期肺癌患者作为研究对象，对晚期NSCLC患者的研究鲜少开展。基于此，本研究将218 例晚期NSCLC 患者随机分组进行干预，以此探讨扶正散结方治疗晚期NSCLC 对免疫功能及miRNA-335-5p 水平的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年8月—2020年9月就诊于徐州市中医院的218 例晚期NSCLC 患者。根据不同治疗方法将患者分为对照组和研究组，均为109 例。对照组男性72 例，女性37 例；年龄45～67 岁，平均（54.35±5.23）岁；病理类型：腺癌55 例，鳞癌25 例，腺鳞癌27 例，其他2 例；平均卡氏评分（48.74±4.18）分。研究组男性74 例，女性35 例；年龄44～67岁，平均（54.07±5.16）岁；病理类型：腺癌57 例，鳞癌26 例，腺鳞癌25 例，其他1 例；平均卡氏评分（48.83±4.11）分。西医诊断标准：参照《中国晚期原发性肺癌诊治专家共识（2016年版）》[7]诊断标准，且经影像学、组织学检查确诊。中医诊断标准：参照2011 版《中医内科学》[8]，症见乏力神疲，面色无华，胸痛胸闷，少痰或痰稀而黏，咳嗽，气短喘促，盗汗，舌淡红且苔少而干，脉象细弱无力，则可诊断为气阴两虚型肺癌。纳入标准：①卡氏评分> 40 分，且预计生存期> 3 个月；②患者≤75 岁；③TNM 分期Ⅲb～Ⅳ期；④自愿签署知情同意书。排除标准：①合并其他重要器官（肝、肺等）恶性肿瘤者；②合并免疫系统疾病者；③治疗前已接受放化疗治疗者；④治疗依从性较差者；⑤合并严重感染者。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），可对比。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

对照组采用TC 化疗方案：化疗第1 天静脉滴注紫杉醇（山西振东制药股份有限公司，国药准字H20058655）+生理盐水，剂量75 mg/m2；注射用卡铂（辰欣药业股份有限公司，国药准字H20059009）加入500 mL 葡萄糖溶液中，静脉滴注；应用西咪替丁、非那根、地塞米松滴注紫杉醇前预处理；化疗21 d 为1 个周期，共3 个周期。研究组在对照组基础上采用扶正散结方辅助治疗，药方：黄芪、薏苡仁各30 g，炒白术、八月扎、浙贝母、山慈菇各15 g，石见穿、石上柏各20 g，法半夏12 g，陈皮、杏仁、防风各10 g；水煎取250 mL，1 剂/d，早晚分服，21 d 为1 个周期，共3 个周期。

1.3 观察指标

1.3.1 疗效 参考RECIST 1.1 版标准[9]并结合肿瘤标志物水平对两组近期（治疗2 个周期后）临床疗效进行评估。治疗后未见新病灶，且原有病灶消失，肿瘤标志物恢复正常，且持续4 周以上，则为完全缓解（CR）；治疗后未见新病灶，且原有病灶最大径之和减少> 50%，肿瘤标志物恢复正常，且持续> 4 周，则为部分缓解（PR）；原有病灶最大径之和减少≤50%，或增加≤20%，肿瘤标志物水平变化不明显，则为疾病稳定（SD）；未达上述标准，则为疾病进展（PD）。疾病控制率（DCR）=（CR+PR+SD）例数/总例数×100%。

1.3.2 血清学指标 于治疗前、治疗2 个周期后采集两组肘正中静脉血5 mL，离心处理后取上层血清置于-80℃冷冻保存待测。血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子β（TGF-β）采用酶联免疫吸附试验测定，肿瘤特异性生长因子（TSGF）采用分光光度比色法测定。

1.3.3 肿瘤标志物 血清采集处理方法同上，癌胚抗原（CEA）、癌抗原125（CA125）、人细胞角蛋白21-1 片段（CYFRA21-1）水平均采用酶联免疫吸附试验测定。miR-335-5p 表达水平通过实时荧光定量聚合酶链反应测定，收集新鲜癌组织及癌旁组织，置入-80℃冰箱冷冻保存，采用总RNA 提取试剂盒（杭州新景生物试剂开发有限公司）将RNA从组织中提取出来，以RNA 为模板，逆转录获得互补DNA，以此为模板行实时荧光定量聚合酶链反应。miR-335-5p 正向引物：5′-GGTCAAGAGCAA TAACGAA-3′，反向引物：5′-AGCAGGAAAGCAGC AATA-3′，分别为24 和25 bp；内参基因U6正向引物：5′-AAAGCAAATCATCGGACGACC-3′，反 向 引物：3′-GTACAACACATTGTTTCCTCGGA-5′，分别为22 和23 bp。反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性14 s，62℃退火62 s，72℃延伸12 s，共40 个循环。采用2-△△Ct法计算miR-335-5p 相对表达水平。

1.3.4 免疫功能 血清采集处理方法同上，采用Cytek Northern Lights 全光谱流式细胞仪（杭州联科生物技术股份有限公司）测定T 淋巴细胞亚群水平。

1.3.5 毒副作用 采用WHO 抗癌药急性及亚急性毒性反应分度标准进行评估，分为Ⅰ～Ⅳ级。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 24.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t值检验；计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验；等级资料以等级表示，比较用秩和检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组疗效比较

两组DCR 比较，差异有统计学意义（χ2=4.163，P=0.041），研究组高于对照组。见表1。

表1 两组疗效比较 [n=109，例（%）]

2.2 两组治疗前后血清学指标比较

两组治疗前TSGF、VEGF、TGF-β 水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。两组治疗后TSGF、VEGF、TGF-β 水平比较，差异有统计学意义（P<0.05），研究组低于对照组。见表2。

表2 两组治疗前后血清学指标比较 （n=109，±s）

表2 两组治疗前后血清学指标比较 （n=109，±s）

组别对照组TSGF/（u/mL）治疗前78.46±8.16治疗后66.16±6.91 VEGF/（ng/L）治疗前160.17±27.19治疗后144.29±23.60 TGF-β/（pg/mL）治疗前69.48±8.73治疗后51.25±6.81研究组t 值P 值79.08±8.30 0.556 0.579 63.54±6.27 2.932 0.004 158.64±26.55 0.420 0.675 133.67±22.81 3.378 0.001 70.22±8.83 0.622 0.535 47.65±6.18 4.087 0.000

2.3 两组治疗前后肿瘤标志物水平比较

两组治疗前CEA、CA125、CYFRA21-1、miR-335-5p 水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。两组治疗后CEA、CA125、CYFRA21-1、miR-335-5p水平比较，差异有统计学意义（P<0.05），研究组CEA、CA125、CYFRA21-1 水平低于对照组，miR-335-5p 水平高于对照组。见表3。

表3 两组治疗前后肿瘤标志物水平比较 （n=109，±s）

表3 两组治疗前后肿瘤标志物水平比较 （n=109，±s）

组别对照组CEA/（ng/mL）治疗前125.71±12.57治疗后103.48±11.29 CA125/（u/mL）治疗前270.14±22.41治疗后171.28±18.97 CYFRA21-1/（ng/mL）治疗前18.37±3.82治疗后9.05±3.02 miR-335-5p治疗前0.83±0.30治疗后0.73±0.22研究组t 值P 值126.24±12.41 0.313 0.755 97.20±11.16 4.130 0.000 268.33±23.09 0.587 0.558 152.18±15.90 8.056 0.000 18.19±3.93 0.343 0.732 7.15±2.88 4.753 0.000 0.80±0.29 0.751 0.453 0.92±0.36 4.702 0.000

2.4 两组治疗前后免疫功能水平比较

两组治疗前CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。两组治疗后CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平比较，差异有统计学意义（P<0.05），研究组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比对照组高，CD8+比对照组低。见表4。

表4 两组治疗前后免疫功能水平比较 （n=109，±s）

表4 两组治疗前后免疫功能水平比较 （n=109，±s）

组别对照组CD3+/%治疗前56.34±3.35治疗后52.76±3.25 CD4+/%治疗前35.87±2.45治疗后33.14±2.17 CD8+/%治疗前28.94±1.86治疗后31.23±2.23 CD4+/CD8+治疗前1.24±0.38治疗后1.20±0.36研究组t 值P 值55.94±3.42 0.872 0.384 60.29±4.11 15.004 0.000 36.10±2.49 0.687 0.493 38.36±2.79 15.419 0.000 28.67±1.80 1.089 0.277 26.14±1.56 19.527 0.000 1.25±0.40 0.189 0.850 1.41±0.59 3.172 0.002

2.5 两组毒副作用比较

两组骨髓抑制、肾功能损伤、肝功能损伤情况比较，差异有统计学意义（P<0.05），研究组优于对照组。见表5。

表5 两组毒副作用比较 （n=109，例）

3 讨论

中医将肺癌归属于“肺积”、“咳嗽”、“息贲”等范畴，是一种局部属实、全身属虚、本虚标实的疾病，病因在于正虚邪聚，阴阳失衡致使正气亏损，邪毒乘虚而入致使肺腑失调，痰热久蕴，瘀结于肺[10]。正气亏虚、肺脾肾同虚是其病灶转移、复发的源头，治疗应以“扶正消积”、“益气养阴”为主要原则[11]。扶正散结方具有益气养阴、活血散瘀、软坚散结之功效，基本符合NSCLC 的治疗原则，可能在治疗中取得较好的疗效。

本研究结果显示，研究组DCR 高于对照组，研究组治疗后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均比对照组高，CD8+比对照组低，且研究组骨髓抑制、肾功能损伤、肝功能损伤情况优于对照组，提示扶正散结方应用于晚期NSCLC 的辅助治疗可有效提高治疗效果，改善免疫功能，减少化疗毒副作用。究其原因在于，扶正散结方具有益气养阴、软坚散结之功效，方中黄芪归脾、肺经，有固表补气之功效，可治气虚乏力、自汗等症；现代药理学证实，黄芪可对自然杀伤细胞、体细胞释放免疫活性物质，增强体液免疫功能，进而发挥一定抗肿瘤作用[12]。薏苡仁归脾、肺经，有健脾除痹、解毒散结之功效，可治肺痈、癌肿；现代动物实验表明薏苡仁中不饱和脂肪酸（亚油酸）可发挥抗癌作用，促使肿瘤细胞变性，还有些成分可使细胞核分裂停止于中期，促使肿瘤细胞凋亡；薏苡仁蛋白中多种成分有益于人体，薏苡仁油脂可有效缓解肌肉痉挛，舒张支气管，从而对呼吸功能起到一定改善作用[13]。炒白术有燥湿利水、止汗之功效，现代药理学证实，白术对癌细胞具有一定细胞毒作用，可抑制肿瘤细胞增殖，并抑制其对组织的侵袭，发挥抗肿瘤作用[14]。八月扎有利湿、解毒、止痛之功效；浙贝母有清热化痰、散结解毒之功效，可治咳嗽、肺痈喉痹、疮疡肿毒等；山慈菇可清热解毒、消痈散结，多用于治疗痈肿疔毒、瘰疬痰核，《滇南本草》中记载：消阴分之痰，止咳嗽；石见穿化学成分三萜成分、全草含甾醇、氨基酸，可治噎膈、痰喘、痈肿；石上柏则有抗癌、清热、解毒之功效，常用于咽喉肿痛、肺热咳嗽；法半夏归肺、胃、脾经，有化痰燥湿之功效，可治痰多咳喘、痰饮眩悸、风痰眩晕；陈皮归肺、脾经，有理气燥湿、健脾化痰之功效，主治痰多咳嗽；杏仁归肺经，有降气平喘止咳之功效；防风有驱风、发汗、祛痰的功效[15-16]。全方兼顾肺脾肾，攻补兼备、寓攻于补，共奏扶正攻邪之功。

有研究表明，肿瘤血管生成是肿瘤细胞生长的重要前提之一，是1 个受多因素影响的复杂过程，VEGF 是促血管生成物质，VEGF/血管内皮生长因子受体-2 是肿瘤血管生成的信号传导途径中重要的一环[17]。TSGF 是来源于恶性肿瘤细胞的可溶性肽类物质，相关研究证实，其水平与肿瘤细胞发生远处转移的风险呈正相关[18]。TGF-β 在肿瘤微环境免疫抑制网络中处于重要一环，与肿瘤转移、预后具有密切关联。肿瘤细胞、肿瘤相关巨噬细胞、调节性T 细胞均可分泌大量TGF-β，TGF-β 可活化微环境中纤维细胞，激活基质上皮细胞和免疫细胞，诱导VEGF 等多种细胞因子表达，改变肿瘤微环境，加速肿瘤血管形成，促使肿瘤转移[19]。本研究结果显示，研究组治疗后血清TSGF、VEGF、TGF-β 水平低于对照组，提示扶正散结方应用于晚期NSCLC 的辅助治疗可改善肿瘤微环境，抑制VEGF/VEGFR-2 信号通路，抑制肿瘤血管生长，可能与扶正散结方的抗肿瘤、提高免疫功能等因素有关，具体机制仍需进一步研究论证。

肿瘤标志物是癌变过程中由肿瘤细胞产生的活性物质，与肿瘤的发生、进展关系密切，同时可准确反映患者病情发展情况，是评估肿瘤疗效、预后的重要指标[20]。miRNA 在肺癌等多种肿瘤中呈异常表达，可对肿瘤细胞的增殖、转移等产生较大影响，检测肿瘤组织中的miRNA 表达水平不仅有助于早期肿瘤诊断，对肿瘤治疗的预后也具有重要意义。以往多项研究指出，miR-335-5p 在胃癌、肺癌、宫颈癌等多种肿瘤组织中呈低表达[21-22]。TANG 等[23]研究也指出，miR-335-5p 在NSCLC 中呈低表达，且miR-335-5p 的过低表达可下调ROCK1 表达，进而对NSCLC 肿瘤细胞的增殖、转移产生抑制。以上研究均提示miR-335-5p 可能是NSCLC 的抑癌因子，肿瘤的进展与其表达下调密切相关，具体机制可能是肿瘤微环境下由免疫细胞分泌的TGF-β 等细胞因子增加，与肿瘤表面的受体相结合，进而激活肿瘤细胞内下游信号通路，抑制miR-335-5p 的表达[24]。本研究结果显示，研究组治疗后血清CEA、CA125、CYFRA21-1 水平均低于对照组，miR-335-5p 表达水平高于对照组，提示扶正散结方应用于晚期NSCLC 的辅助治疗可有效改善预后。

综上所述，扶正散结方应用于晚期NSCLC 的辅助治疗可提高近期疗效，减少化疗毒性反应，改善肿瘤微环境，增强miR-335-5p 表达，提高免疫功能，改善预后。