表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂治疗后非小细胞肺癌患者预后的影响因素分析

于 淼 陈晓玲 张瀛丹 李孝琪 乌兰图雅 张彬彬 门桐林

1.沈阳市第十人民医院肿瘤一科，辽宁沈阳 110045；2.沈阳市第十人民医院病理科，辽宁沈阳 110045；3.沈阳市第十人民医院介入科，辽宁沈阳 110045

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）已成为全球癌症相关死亡的主要原因之一[1]。自发现表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）为驱动NSCLC 的关键基因以来，EGFR 信号通路也成为治疗NSCLC 的重要途径[2]。而EGFR 酪氨酸激酶抑制剂（EGFR tyrosine kinase inhibitors，EGFRTKIs）可延长EGFR 突变的NSCLC 患者的无进展生存期[3-4]。尽管绝大数EGFR 突变NSCLC 患者对EGFRTKIs 治疗呈阳性反应，但仍有5%～30%的EGFR 突变NSCLC 患者对EGFR-TKIs 治疗不敏感，影响预后[5]。Hsu 等[6]的研究表明EGFR 突变的NSCLC 患者对程序性死亡配体1（programmed death ligand-1，PD-L1）检查点阻断反应低；Brody 等[7]进行的汇总分析显示，对EGFR-TKIs 治疗不敏感的EGFR 突变NSCLC 患者具有更高的PD-L1 表达水平，以上研究提示PD-L1参与了EGFR-TKIs 治疗后NSCLC 患者的预后过程。但EGFR-TKIs 治疗后NSCLC 患者预后具体受何种因素的影响，目前国内临床鲜有报道，因此本研究选取经EGFR-TKIs 治疗的NSCLC 患者，收集其临床资料，检测其PD-L1 水平，探讨EGFR-TKIs 治疗后NSCLC 患者预后的影响因素。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018 年1 月至2019 年9 月沈阳市第十人民医院（以下简称“我院”）就诊的161 例NSCLC 患者，其中男55 例，女106 例；年龄50～75 岁，平均（63.80±5.12）岁。

纳入标准：①符合NSCLC 的诊断标准[8]，并经病理学检查确诊为原发性NSCLC；②临床分期Ⅲb～Ⅳ期且为EGFR 突变的NSCLC；③经EGFR-TKIs 治疗；④签署知情同意书。排除标准：①伴有T790M 和第20 外显子插入；②合并严重肝肾、心血管系统等疾病或合并其他器官或组织肿瘤；③治疗中途停药、换药、减药；④依从性差。记录患者的预后情况，参照世界卫生组织发布的实体瘤临床疗效评价标准1.1[9]评定，分为4 个等级：进展、稳定、部分缓解、完全缓解。其中进展为预后不良，稳定、部分缓解、完全缓解为预后良好。按照预后情况将患者分为预后不良组（32 例）和预后良好组（129 例）。

1.2 研究方法

收集患者入院时的基本资料，包括年龄、性别、体重指数（body mass index，BMI）、吸烟史、饮酒史、合并基础疾病情况、临床分期、血清学指标[癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、白蛋白、球蛋白]、血肌酐、尿素氮、动脉血二氧化碳分压、动脉血氧分压、呼吸双相平均肺密度比值（mean lung density ratio of expiration/inspiration，MLD E/I）、呼吸双相体素指数介于-850 HU 到-950 HU 肺容积占总肺容积百分比的变化量（change in lung volume as a percentage of total lung volume with a respiratory bipolar voxel index between -850 HU and -950 HU，VI-850/-950E-I）、第一秒用力呼气量占用力肺活量百分率。

PD-L1 表达水平检测：患者入院后及治疗前空腹采集外周静脉血5 ml，静置30 min 后收集血清冷冻于-20°C 冰箱中备用。使用RNA 提取试剂盒（购自Thermo Fisher Scientifc 公司，批号：S01925）进行提取，提取后置于-80℃冰箱保存。使用TRIzol 分离总RNA；使用BioTek SynergyTMH1 杂交解读器测定RNA纯度；使用Takara Biotechnology 公司生产的PrimeScript RT 试剂盒将RNA 样本逆转录为cDNA；使用Thermo Fisher Scientific 生产的SYBR Green PCR Master Mix试剂盒和ABI 7500 Real-Time PCR 系统进行RTqPCR 反应，并进行PD-L1 mRNA 相对于甘油醛-3-磷酸脱氢酶的水平检测。PCR 条件设置：在95℃初始变性1 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，在72℃延伸1 min，35 个循环，最终延伸至72°C，持续10 min。使用2-ΔΔCt公式计算基因表达的相对倍数变化。PCR 引物序列为5’-TTGCTGAACGCCCCATACAA-3’（正向引物），5’-TCAGTGCTACACCAAGAGCAT-3’（反向引物），5’-AAGTCAATGCCCCAT ACCGC-3’（正向引物），5’-TTCTGGATAACCCTCGGCCT-3’（反向引物）。免疫印迹法检测PD-L1 蛋白表达：将蛋白样品悬浮于10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液中，以80 V 持续30 min 后，90 V 持续90 min 进行电泳。应用电转仪将凝胶上的蛋白样品转移到聚偏二氟乙烯膜膜上，3%BSA 在37℃封闭2 h。以1∶1000 稀释兔抗人PD-L1 单克隆抗体（Abcam 公司，ab205921）和内参β-actin 抗体（1∶4000 稀释）4℃孵育过夜；用武汉艾美捷科技有限公司PD-L1抗血清[纯化的山羊抗兔（二抗抗体1∶10 000）稀释]进行免疫印迹。采集图像后，用凝胶成像仪对免疫印迹条带灰度值进行分析，最终得到PD-L1 的表达水平。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 对所得数据进行统计学分析，经Shapiro-Wilk 正态性检验，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t 检验；计数资料采用例数和百分率表示，组间比较采用χ2检验。等级资料采用秩和检验。采用logistic 回归模型分析影响因素。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组基线资料及PD-L1 水平比较

预后不良组的PD-L1、血清CEA 水平高于预后良好组，血清白蛋白、MLD E/I、VI-850/-950E-I 低于预后良好组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

表1 两组基线资料及PD-L1 水平比较

2.2 EGFR-TKIs 治疗后NSCLC 患者预后的影响因素分析

以单因素分析中差异有统计学差异因素为自变量，以预后情况作为因变量（预后不良=0，预后良好=1），进行多因素分析，结果显示，PD-L1、血清CEA、血清白蛋白是EGFR-TKIs 治疗后NSCLC 患者预后的影响因素（P ＜0.05）。见表2。

表2 EGFR-TKIs 治疗后NSCLC 患者预后的影响因素分析

3 讨论

近年来，随着致癌驱动EGFR 基因突变/易位的发现和TKIs 疗法的发展，NSCLC 治疗进入了新时代，患者的生存期有了极大提高[10-11]。然而约30%的EGFR突变NSCLC 患者对EGFR-TKIs 治疗出现内源性耐药，严重影响其预后[12]。Incorvaia 等[13]通过测量肿瘤和免疫细胞上PD-L1 的表达水平发现，出现耐药的患者中PD-L1 水平升高，Kloten 等[14]指出PD-L1 的高表达预示着EGFR 突变NSCLC 患者对EGFR-TKIs治疗不敏感。

本研究多因素分析结果显示PD-L1 是EGFRTKIs 治疗后NSCLC 患者预后的影响因素。NSCLC 的癌症因子通过EGFR 途径增强了肿瘤组织对PD-1阻断的敏感性，而EGFR-TKIs 的关键在于抑制PD-1和EGFR 的结合[15]。PD-L1 可诱导PD-1 的构象变化从而导致细胞质免疫受体酪氨酸基抑制基序和免疫受体酪氨酸基开关基序磷酸化，磷酸化的酪氨酸基序随后募集蛋白酪氨酸磷酸酶（Src homology，SHP）-2和SHP-1 蛋白酪氨酸磷酸酶以减弱T 细胞激活信号，降低T 细胞的活性[16-17]；PD-L1 还可与CD80 相互作用，并将抑制信号传递至活化的T 细胞，减弱患者免疫功能。PD-L1 可保护肿瘤细胞免受Ⅰ型和Ⅱ型干扰素作用及细胞毒性T 细胞介导的细胞溶解作用，使NSCLC 肿瘤细胞经EGFR-TKIs 治疗后仍可以生长增殖[18]。在Han 等[19]的研究中发现，基于抗体的PDL1 靶向治疗可降低NSCLC 肿瘤细胞中的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白活性和糖酵解代谢，抑制肿瘤细胞增殖、转移过程。Kang 等[20]的研究指出，高PD-L1 水平与NSCLC 患者经EGFR-TKIs 治疗后疾病进展相关，证实PD-L1 参与了EGFR-TKIs 治疗后NSCLC患者预后过程。

CEA 是仅存在于癌症和胚胎组织中的一种糖蛋白，直接作用于肿瘤细胞之间的黏附反应，可调节癌细胞的分化、凋亡、浸润和转移[21]。血清CEA 在阻断分化过程中起主导作用，与细胞转化中的Myc 基因和B 淋巴细胞瘤-2 基因具有协同作用，可抑制细胞死亡[22]。有研究指出，经EGFR-TKIs 治疗后NSCLC 患者血清CEA＞32 ng/ml 与其水平为5～32、＜5 ng/ml 时的无进展生存期分别为8.8、11.3、14.4 个月；血清CEA≥5 ng/ml患者的无进展生存期的相对危险度是血清CEA＜5 ng/ml 患者的2.161 倍，提示血清CEA 是影响EGFR-TKIs 治疗后NSCLC 患者预后的因素[23-24]。NSCLC患者由于肿瘤细胞的活跃代谢状态和能量的大量消耗，使白蛋白合成减少，导致患者处于营养不良状态，可增加感染风险和EGFR-TKIs 治疗毒性，降低患者免疫功能等[25]。在Dal 等[26]的研究中也指出低水平血清白蛋白的EGFR-TKIs 治疗后NSCLC 患者（<35 g/L）与正常血清白蛋白水平（≥35 g/L）患者预后不良的风险比为1.73，证实血清白蛋白与EGFR-TKIs 治疗后NSCLC 患者的预后有关。

综上所述，PD-L1、血清CEA、血清白蛋白与EGFR-TKIs 治疗后NSCLC 患者的预后情况存在密切关系。但本研究仍存在一定的局限性，例如样本量较小等，今后将深入研究。