基于网络药理学探讨桂枝芍药知母汤治疗痛风的作用机制

何家颖 刘明岭 李淑瑶 王馨玉 关 彤

1.广州中医药大学第一临床医学院，广东广州 510405；2.广州中医药大学第一附属医院风湿病科，广东广州 510405

痛风是一种尿酸盐沉积所致的关节病，与嘌呤代谢紊乱和/或尿酸排泄减少所致的高尿酸血症相关。目前我国的痛风患病率为1%～3%，呈逐年上升、年轻化的趋势[1]。痛风易反复发作，长期服药可导致肝、肾功能损害，而且在降尿酸的初始阶段还可能诱导痛风急性发作[2]。桂枝芍药知母汤具有祛风除湿、温经散寒、滋阴清热的功效，可治疗痛风的外因（风寒湿邪侵袭）和内因（肝肾虚损，营卫不和）。药理研究表明桂枝芍药知母汤具有抗炎、镇痛、保护肾功能和促进尿酸排泄的作用[3]。

网络药理学从多维度视角理解疾病的分子基础，预测药物的药理学机制[4]，揭示了中医药的科学性和有效性。本研究基于网络药理学方法，从成分、靶点、通路等多方面共同探讨桂枝芍药知母汤治疗痛风的作用机制。

1 材料与方法

1.1 收集桂枝芍药知母汤的活性成分、对应靶点和痛风靶点

在中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）数据库中分别以“桂枝、白芍、知母、甘草、麻黄、生姜、白术、防风、附子”为检索词，以口服生物利用度≥30%和类药性≥0.18 为筛选条件检索活性成分，结合相关文献补充活性成分。在TCMSP 数据库中获取对应靶点，采用Uniprot 数据库进行标准化处理。以“gout”为检索词分别检索OMIM、GeneCards、DisGeNET 和TTD 数据库，收集合并痛风相关靶点。

1.2 构建疾病-药物-靶点-成分网络和蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络

利用Cytoscape 软件中的Merge 插件将药物与疾病靶点取交集，并构建疾病-药物-靶点-成分网络。设置物种为人类，将共同靶点分别输入STRING 数据库和Metascape 数据库，应用Cytoscape 软件构建PPI网络图和绘制PPI 富集分析图。

1.3 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析

设定阈值为P ＜0.05，应用R 软件对共同靶点进行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，并绘制条形图。

2 结果

2.1 桂枝芍药知母汤活性成分和对应靶点、疾病靶点、共同靶点

从TCMSP 数据库中获得桂枝芍药知母汤活性成分119 个，从文献补充活性成分6 个，总活性成分125 个，对应靶点218 个，疾病靶点903 个，共同靶点60 个。

2.2 疾病-药物-靶点-成分网络

疾病-药物-靶点-成分网络见图1，该网络包含180 个节点，458 条边，节点颜色越深，度值越高。经统计，度值前8 的核心成分见表1，其中槲皮素、山柰酚、柚皮素和β-谷甾醇既是核心成分又是共同成分。

表1 核心成分

图1 疾病-药物-靶点-成分网络图

2.3 PPI 网络和PPI 富集分析

PPI 网络见图2，该网络包含58 个节点，595 条边，节点越大，颜色越深，度值越高。核心靶点包括IL-6、TNF、GAPDH、VEGFA、TP53、PTGS2、IL-1B、TLR4 和JUN（原癌基因）。PPI 富集分析见图3，形状相同的靶点共同参与某种生物过程或分子功能或细胞组分。

图2 蛋白质-蛋白质相互作用网络图

图3 蛋白质-蛋白质相互作用富集分析图

2.4 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析

GO 富集分析获得条目95 个，KEGG 通路富集分析获得通路130 条，按P 值从小到大排列，排名前20的GO 条目和通路绘制成条形图，见图4～5。GO 功能富集分析主要涉及磷酸酶结合、金属内肽酶活性、MAPK活性、转录因子结合、氧化还原酶活性等分子功能，KEGG 通路富集分析共获得7 条与痛风密切相关的信号通路，分别是TNF 信号通路、TLR 信号通路、IL-17 信号通路、Th17 细胞分化、CLR 信号通路、NF-κB 信号通路和糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路，同时还获得流体剪切应力和动脉粥样硬化、类风湿关节炎等信号通路。

图4 GO 分析图

3 讨论

痛风急性期的特征之一是发病部位存在中性粒细胞募集[5]，典型表现是关节红、肿、热、痛。β-谷甾醇可抑制中性粒细胞迁移以减轻炎症[6]，其他核心成分也都具有抗炎作用。槲皮素、山柰酚、柚皮素、木犀草素、升麻素和肉桂醛具有镇痛作用，6-姜酚、升麻素和肉桂醛具有解热作用[7-13]。高尿酸血症是痛风的生化基础，木犀草素和山柰酚作为黄嘌呤氧化酶抑制剂，其能阻断次黄嘌呤、黄嘌呤转化为尿酸[14]。

本研究发现核心靶点多与炎症相关，其中TP53的功能获得性突变在炎症中起关键作用[15]。IL-1β 和IL-6 皆为痛风重要的炎症介质，IL-1β 是调节炎症的起始因子，TNF-α 通过调节pro-IL-1β mRNA 的表达可增加IL-1β 的分泌[16]。IL-6 可扩大炎症，且与关节畸形、骨破坏、痛风石有关[17]。GAPDH 是巨噬细胞产生IL-1β、IL-6 等促炎因子所必需的[18]，PTGS2 在促炎因子的刺激下产生前列腺素参与炎症。VEGF 与炎症呈正相关，VEGFA 能增加血管通透性，从而刺激炎症形成和发展[19]。

PPI 富集分析发现桂枝芍药知母汤不仅作用于炎症，还作用于痛风石的生长、尿酸代谢等。图3A 主要与转录因子有关，NF-κB 是痛风最重要的转录因子之一，其能调节炎症反应，还能促进动脉粥样硬化相关基因的表达。图3B 主要与肽酶活性、细胞外基质有关，其与MMP1、MMP2、MMP9 联系最紧密。研究发现痛风石中的巨噬细胞可产生MMP2 和MMP9，MMP的主要功能是降解细胞外基质[20]，痛风石外层的肉芽肿会随细胞外基质的降解而生长，同时巨噬细胞会发生凋亡，这可能会限制巨噬细胞的破坏潜力[21]。图3C主要与血脂代谢有关，血脂与尿酸呈正相关[22-24]，桂枝芍药知母汤通过调节APOB、LDLR 和PON1 可降低尿酸和血脂水平。

GO 富集分析发现磷酸酶结合和MAPK 活性参与痛风骨破坏、细胞代谢和炎症过程。痛风患者的骨吸收表面、关节液及痛风石内存在大量的酸性磷酸酶，此酶与破骨细胞的活性呈正相关，可增强骨吸收，促进骨破坏。受尿酸单钠晶体刺激时MAPK 被激活，其参与细胞凋亡的延迟和NETosis[25]。NETosis 是中性粒细胞特殊的死亡方式，发生过程中会形成中性粒细胞胞外诱捕网[26]，中性粒细胞胞外诱捕网可产生中性粒细胞胞外诱捕网交联体，其含有的中性粒细胞蛋白酶可降解促炎因子，限制炎症反应[5]。

图5 KEGG 通路富集分析图

KEGG 通路富集分析共获得7 条与痛风密切相关的信号通路。其中AGE-RAGE、TNF 和TLR 的信号传导均受下游NF-κB 和MAPK 信号通路的控制。AGE-RAGE 信号传导通过激活NADPH 氧化酶、蛋白激酶C 和MAPK 等多条信号通路，从而激活NF-κB，参与炎症反应。可溶性TNF 通过TNFR1 传递的信号通路主要激活促炎通路[27]，包括NF-κB 和MAPK 信号通路，最终导致白细胞激活和募集、促炎因子产生、炎症介质合成等。TLR 信号传导途径：①MyD88 依赖性途径：尿酸单钠晶体与TLR 结合后可活化MyD88，继而激活下游NF-κB 和MAPK 信号通路产生促炎因子，快速激活固有免疫。②MyD88 非依赖性途径：TLR激活T 细胞并介导其趋化，从而激活适应性免疫。CLR 也能激活固有免疫和适应性免疫，同时还参与了多种关节病[28]。CLR 通过激活NLRP3炎症小体，产生IL-1β，其与IL-6、TNF 等细胞因子共同促进Th1 和Th17 细胞分化，参与痛风的炎症反应。Th17 细胞的系统分化、成熟和局部募集及其产物IL-17 是痛风引起靶组织损伤的潜在机制之一。IL-17 抗体可调节尿酸单钠晶体引起的痛风性炎症，减轻关节症状和白细胞炎症浸润[29]。

综上所述，本研究借助网络药理学的方法发现：①桂枝芍药知母汤在治疗痛风的炎症反应、尿酸代谢紊乱、骨破坏等多个环节中发挥显著作用。②NF-κB和MAPK 信号通路是痛风发病的核心，阻断他们是痛风治疗的关键。③巨噬细胞的凋亡和中性粒细胞胞外诱捕网的产生都与痛风自限性有关，另外IL-17 抗体可减轻痛风性关节炎的关节症状和白细胞炎症浸润，这些都为痛风的治疗提供了新思路。④桂枝芍药知母汤通过调节APOB、LDLR 和PON1 靶点，NF-κB和糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路有助于治疗高脂血症、动脉粥样硬化等痛风常见的合并症。本研究具有一定的局限性，一是着重探讨痛风的炎症反应，对尿酸代谢、骨破坏等方面的研究尚未深入；二是本研究的结论有待今后的临床试验和实验研究验证。