紫檀芪对肥胖孕鼠肝脏脂代谢的影响

邢小芳，柏 青，何飞敏，邵文璠，李春健，黄 晶，华 蕾，王永梅

(云南省第三人民医院，云南 昆明 650011)

妊娠后女性体重会大幅增加，只要没有超出标准范围，一般不会造成不良影响，但如果孕妇过度肥胖，会给自身和胎儿带来不利影响。对孕妇自身而言，过度肥胖可引起难产、胎儿死亡等，产后可诱发高血糖、高血脂、高血压等[1-2]。对胎儿可导致发育迟缓，甚至引起新生儿神经管缺陷，另外胎儿在长大后相较于正常人也容易发生肥胖、高血脂、高血压等[3-4]。目前对于妊娠期肥胖的治疗以锻炼和控制饮食为主，但是多数孕妇依从性较差；部分肥胖孕妇使用辛伐他汀和二甲双胍治疗[5]，但均有不良反应，耐受性较差，因此开发安全的药物用于妊娠期肥胖的治疗势在必行。紫檀芪是葡萄中的活性成分，其和白藜芦醇在药理活性上具有一定的相似性[6]，理论上有用于妊娠期肥胖治疗的潜在价值。本研究通过构建妊娠期肥胖小鼠模型，探讨了紫檀芪对糖脂代谢的影响及可能作用机制，以为其临床应用提供理论依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 60只雌性和30只雄性清洁级昆明小鼠，均购于昆明医科大学动物实验中心，动物合格证号：SCXK(滇)K2020-0004。购买后饲养于云南中医药大学标准动物房，温度控制为21～23 ℃，湿度60%，光照/黑暗12 h，小鼠日常给予自来水饮用和普通饲料喂养，造模时相应小鼠给予高脂饲料喂养，饲料均购于昆明医科大学动物实验中心。动物实验经云南省第三人民医院伦理委员会批准(202002)。

1.2实验试剂 0.9%氯化钠注射液购于贵州科伦药业有限公司；胰岛素ELISA试剂盒购于上海酶联生物科技公司；高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)生化试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)生化试剂盒、总胆固醇(TC)生化试剂盒和三酰甘油(TG)生化试剂盒购于南京建成生物工程研究所；PVDF膜购于Millipore公司；GAPDH单克隆抗体、CD36单克隆抗体和载脂蛋白B(Aop B)单克隆抗体购于Santa Cruz公司；成纤维细胞生长因子21(FGF21)单克隆抗体购于Abcam公司；二抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3仪器设备 高精度防水电子天平(FX-200GD型，日本 AND 公司)；低温高速离心机(Mini Spin型，德国 Eppendorf 公司)；酶标仪(MLDEL680型，美国 Bio-Rad公司)；凝胶电泳图像分析仪(Gel Doc XR型，美国 Bio-Rad公司)；石蜡切片机(RM2235型，德国 LEICA 公司)；石蜡包埋机(TKD-BMB型，湖北康强医疗器械有限公司)；倒置/荧光/相差显微镜(IX73型，日本 OLYMPUS 公司)；蛋白电泳系统(Mini-PROTEAN Tetra Cell型，美国伯乐公司)。

1.4实验方法 所有小鼠均给予适应性喂养1周，1周后随机选取10只雌鼠作为正常组，其余50只雌鼠给予高脂饲料(83.25%基础饲料、10%猪油、5%蔗糖、1.5%胆固醇和0.25%胆酸钠)喂养2个月建立肥胖模型。2个月后，将所有小鼠按照雄性和雌性1∶2比例进行合笼交配。次日清晨将查到阴道栓的肥胖孕鼠随机分为模型组、紫檀芪低剂量组、紫檀芪中剂量组和紫檀芪高剂量组，每组12只。受孕4 d后，每天10：00-12：00，正常组和模型组孕鼠给予生理盐水1 mL灌胃，紫檀芪低、中、高剂量组孕鼠分别给予2.5 mg/(kg·d)、5 mg/(kg·d)、10 mg/(kg·d)紫檀芪悬混液(相应剂量的紫檀芪悬混于1 mL生理盐水中)灌胃，均连续灌胃2周。灌胃期间正常组孕鼠给予普通饲料喂养，各造模孕鼠继续给予高脂饲料喂养。

1.5动物取材 末次灌胃结束后，麻醉孕鼠后腹主动脉取血，然后取出肝脏，一部分置入超低温冰箱中用于相关蛋白表达检测，一部分置入多聚甲醛溶液中用于病理学观察和相关蛋白免疫荧光检测。

1.6检测指标及方法

1.6.1血脂和血糖、胰岛素 按照试剂盒提供的说明书检测血脂4项(TC、TG、HDL-C、LDL-C)、血糖、胰岛素水平，计算胰岛素抵抗指数。胰岛素抵抗指数=血糖×胰岛素/22.5。

1.6.2组织病理学表现 将之前用固定液固定的组织取出，用清水洗干净组织，把组织切成小块，置于包埋盒中，自动脱水机脱水，二甲苯透明后石蜡包埋；切片：厚度为4 μm；展片后进行常规HE染色，置入载玻片封片即完成，之后采用荧光倒置显微镜收集图像，每张切片选取5个不同的视野。

1.6.3肝脏组织中FGF21、CD36和Apo B免疫荧光染色 将组织切片后，加入二甲苯10 min，共2次；100%的乙醇10 min，共2 次；95%的乙醇10 min；75%的乙醇10 min；TBST5 min，共3次；内源性过氧化物酶阻断液 AR1108 10 min；0.25%的胰酶10～20 min/100 ℃PBS煮10 min ；去离子水5 min，共3 次； 5% 的BSA 封闭1 min；一抗(1∶50)4 ℃过夜；次日TBST 5洗涤3次；二抗(1∶100)室温避光孵育 2 h；TBST洗涤3次； 晾干，加入DIPI 50 μL避光封片；荧光倒置显微镜观察并收集图像，每个图片选取5个不同的视野。

1.6.4肝脏组织中FGF21、CD36和ApoB表达情况 Western blot法检测：采用总蛋白提取试剂盒提取总蛋白；运用BCA法对蛋白进行定量，定量后调平；行SDS-PAGE电泳，电泳时压缩胶电压为60 V，分析胶电压为100 V，待电泳样品分离至胶下缘时结束电泳；转膜；恒定电流260 mA 转膜 1 h；将膜放入封闭液中，室温摇床封闭2 h；一抗孵育4 ℃过夜；二抗室温摇床孵育1 h；用凝胶成像系统进行分析并采集图像，结果采用检测蛋白的灰度值/GAPDH的灰度值表示。

2 结 果

2.1各组血糖、胰岛素和血脂水平比较 模型组孕鼠血清TG、TC、LDL-C水平及血糖、胰岛素、胰岛素抵抗指数均明显高于正常组(P均<0.05)，血清HDL-C水平明显低于正常组(P<0.05)；紫檀芪各组孕鼠血清TG、TC、LDL-C水平及血糖、胰岛素、胰岛素抵抗指数均明显低于模型组(P均<0.05)，血清HDL-C水平均明显高于模型组(P均<0.05)；紫檀芪中、高剂量组血清TG、LDL-C、血糖及紫檀芪高剂量组TC、胰岛素、胰岛素抵抗指数均明显低于紫檀芪低剂量组(P均<0.05)；紫檀芪高剂量组血清HDL-C水平均明显高于紫檀芪低、中剂量组(P均<0.05)。见表1。

表1 正常组和肥胖各组孕鼠血脂指标及血糖、胰岛素、胰岛素抵抗指数比较

2.2各组肝脏组织病理学表现 正常组孕鼠肝细胞大小均一，细胞核基本位于细胞中央，分布均匀；模型组孕鼠肝脏组织中弥漫有大量的脂肪空泡，无明显炎症细胞浸润；相较于模型组，紫檀芪各组孕鼠肝脏组织脂肪空泡明显减少，且均无炎症细胞浸润。见图1。

图1 正常组和肥胖各组孕鼠肝脏组织HE染色情况(×400)

2.3各组肝脏组织中FGF21、CD36和ApoB免疫荧光染色表现 细胞核染色为蓝色，FGF21、CD36和ApoB阳性表达为绿色；与正常组比较，模型组孕鼠肝脏组织中FGF21、CD36阳性表达明显增多，Apo B阳性表达明显减少；与模型组比较，紫檀芪各组孕鼠肝脏组织中FGF21和CD36阳性表达均明显减少，Apo B阳性表达均明显增多；与紫檀芪低、中剂量组比较，紫檀芪高剂量组FGF21和CD36阳性表达更少，Apo B阳性表达更多。见图2。

图2 正常组和肥胖各组孕鼠肝脏组织中FGF21、CD36和Apo B免疫荧光染色情况(×200)

2.4各组肝脏组织中FGF21、CD36和ApoB表达情况 模型组孕鼠肝脏组织中FGF21和CD36相对表达量均明显高于正常组(P均<0.05)，Apo B相对表达量明显低于正常组(P<0.05)；紫檀芪各组孕鼠肝脏组织中FGF21和CD36相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05)，Apo B相对表达量均明显高于模型组(P均<0.05)；紫檀芪中、高剂量组FGF21相对表达量均明显低于紫檀芪低剂量组(P均<0.05)，且紫檀芪高剂量组明显低于紫檀芪中剂量组(P<0.05)；紫檀芪高剂量组CD36相对表达量均明显低于紫檀芪低、中剂量组(P均<0.05)，Apo B相对表达量均明显高于紫檀芪低、中剂量组(P均<0.05)。见图3和表2。

图3 正常组和肥胖各组孕鼠肝脏组织中FGF21、CD36和Apo B表达情况

表2 正常组和肥胖各组孕鼠肝脏组织中FGF21、CD36和Apo B相对表达量比较

3 讨 论

肥胖孕鼠造模较为复杂，理论上妊娠后给予肥胖造模更符合孕期肥胖的特点，但啮齿类动物的孕期较短，小鼠孕期只有21 d，在这么短的时间内还没有一种药物可另其急剧发胖[7]。为此本实验参考文献报道[8],先高脂饮食建立肥胖模型，后合笼受孕，另外在整个孕期继续给予高脂饮食喂养，以尽可能地保证动物模型与人孕期肥胖相似。实验结果显示，模型组孕鼠肝脏HE染色见大量脂肪空泡，血液学检测存在胰岛素抵抗状态和明显的高血脂，提示造模相对成功。

目前研究认为紫檀芪没有毒副作用，其虽然不能降低体重，但具有降低血脂作用[9-10]。如胡向阳等[11]研究发现，紫檀芪能够明显降低高血脂症小鼠TG和LDL-C水平，改善高血脂症小鼠状态。Zhang等[12]研究证实紫檀芪可以调节动脉粥样硬化小鼠血清中血脂的含量，保护血管。本研究结果显示，紫檀芪各组孕鼠血清TG、TC和LDL-C水平均明显低于模型组，HDL-C水平明显高于模型组。提示紫檀芪可调节肥胖孕鼠血脂代谢。

肥胖和糖尿病具有明显的相关性。一项流行病学调查结果显示，肥胖人群发生糖尿病的风险是正常人群的3倍，在肥胖早期可能存在胰岛素抵抗[13]。肥胖不仅可以促进胰岛素抵抗的发展，也是导致机体发生糖脂代谢紊乱的核心因素[14]。本研究结果显示，模型组孕鼠血糖、胰岛素和胰岛素抵抗指数均明显升高，紫檀芪各组上述指标均明显降低。提示肥胖孕鼠存在高血糖、高胰岛素血症和胰岛素抵抗，而紫檀芪可以明显改善这一状态。

肥胖患者存在脂质代谢紊乱，脂代谢基因FGF21、CD36、Apo B与肥胖密切相关。FGF21主要由肝细胞分泌，其可以促进脂肪细胞摄取葡萄糖，增加胰岛素的敏感性，降低血糖，但其过量分泌可促进脂质物质，特别是脂质中TG的合成[15]。CD36又称之为脂肪酸转位酶，其是调控外源性脂肪酸进入细胞的关键因子，其表达过多会造成外源性脂肪酸在器官和组织中过量积累，进而造成肥胖；Apo B在功能上与CD36正好相反，其主要作用为帮助内源性脂肪酸从细胞中转运出来，进而分解代谢掉[16-17]。FGF21、CD36和Apo B共同作用，促进了肥胖的发生和发展，调节三者的表达可能有预防肥胖发生或抑制肥胖相关疾病进展的作用。本研究结果显示，模型组孕鼠肝脏组织中FGF21、CD36表达量明显高于正常组，Apo B表达量明显低于正常组，说明肥胖孕鼠存在FGF21、CD36和Apo B表达异常；与模型组比较，紫檀芪各组小鼠FGF21、CD36表达量明显降低，Apo B表达量明显升高，且紫檀芪高剂量组各指标改善更明显，说明紫檀芪可调节FGF21、CD36和Apo B的表达，并呈一定剂量依赖性。

综上所述，紫檀芪可调节肥胖孕鼠的糖脂代谢，其作用机制可能与调节FGF21、CD36、Apo B表达有关。但本实验没有进一步观察紫檀芪对肥胖孕鼠子代的影响，特别是安全性方面的影响，需要后续进一步研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。