嗅闻佛手柑精油对阿尔兹海默症小鼠的神经保护作用研究

胡慧艳，任婧楠，李晓，潘思轶，范刚

华中农业大学食品科学技术学院/环境食品学教育部重点实验室，武汉 430070

阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease，AD)是一种以记忆丧失和认知功能障碍为特点的神经退行性疾病。目前AD的具体发病机制还不是十分清楚，但大量的研究表明，淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)沉积、tau蛋白过度磷酸化、乙酰胆碱水平的降低、炎症反应、氧化应激、线粒体功能障碍、不稳定代偿功能和金属失调可能在AD发病机制中发挥重要作用[1]，其中Aβ沉积、乙酰胆碱水平的降低、氧化应激和炎症反应起到了关键性作用。

目前，FDA批准的传统药物基于2种作用机制，包括非竞争性N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂(美金刚胺)和胆碱酯酶抑制剂(盐酸多奈哌齐、甘兰坦胺和利瓦斯替胺)[2]。但是，市场上可用的这些药物成本高，副作用多，并且通常无法阻止疾病的发展。因此，如何有效治疗阿尔兹海默症仍然是个挑战。

芳香疗法在阿尔兹海默症中的应用已成为学者的研究热点。佛手柑精油(bergamot essential oil,BEO)是最常见的精油之一，由挥发性芳香族萜烯和加氧衍生物如芳樟醇组成[3]，之前的研究证明其具有神经保护和抗炎的作用[4-5]，但是针对D-gal和AlCl3联合诱导模型的研究较少，且摄入方式多为灌胃和腹腔注射的方式。本研究通过行为学和生化指标的检测来评估嗅闻BEO对D-gal和AlCl3引起的阿尔兹海默症的影响，探讨BEO在阿尔兹海默症的治疗中的作用机制，为芳香疗法辅助治疗阿尔兹海默症提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

佛手柑精油，上海妙尔香精香料有限公司；D-半乳糖(D-galactose，D-gal)、三氯化铝(AlCl3)，国药集团化学试剂有限公司；盐酸多奈哌齐(Donepezil hydrochloride)，卫材(中国)制药有限公司;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、β淀粉样蛋白(Aβ)、乙酰胆碱酯酶(AchE)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)检测试剂盒，上海优选生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

Y-迷宫，北京众实迪创有限公司；高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗机械厂；气相色谱-质谱联用仪(Agilent6890N)，美国Agilent公司；SPME装置(50/30 μmDVB/CAR/PDMS)，美国Supeleo公司。

1.3 实验动物

SPF级4周龄的雄性昆明小鼠(KM)35只。实验动物和饲料购自华中农业大学实验动物中心，动物合格证号为SCXK(鄂)2020-0019。自由饮水饮食，日光灯人工照明(照明时间：08:00-20:00)，温度22±2 ℃。所有的实验都得到了华中农业大学科学伦理委员会的批准(伦理号为202110240010)。

1.4 佛手柑精油成分定性分析

为了确定小鼠嗅闻佛手柑精油时的挥发性成分，采用固相微萃取的方法测定了佛手柑精油的成分组成[6]。运用NIST05 与Wiley.7n 谱库进行检索，利用C6～C20正构烷烃的保留时间计算出每种香气物质的保留指数，再结合文献的保留指数进行比对，确认各个香气物质的化学组成。气相色谱-质谱联用仪色谱与质谱条件参考杨子玉[6]的方法。

1.5 AD的诱导

制备质量浓度为24 g/LD-gal和 2 g/L AlCl3溶液。将上述溶液等体积混合后得到12 g/L的D-gal和1 g/L的AlCl3的混合溶液。小鼠连续49 d注射该混合溶液以诱导阿尔兹海默症。

1.6 动物建模与分组

小鼠被随机分为5组(n=7)。第1组(对照组,Con)：连续49 d接受生理盐水腹腔注射。第2组(模型组,Mod)：腹腔注射D-gal(120 mg/(kg·d))和AlCl3(10 mg/(kg·d))，连续49 d。第3组(盐酸多奈哌齐组,Don)：在腹腔注射D-gal和AlCl328 d后，每天喂服盐酸多奈哌齐(2 mg/(kg·d))21 d。第4组( 1 h )和第5组( 2 h )：在腹腔注射D-gal和AlCl328 d后，分别嗅闻75% BEO 1 h和2 h，为期21 d。实验过程如图1所示。

1.7 旷场实验

旷场实验(open field test，OFT)是用来确定小鼠在陌生环境中的行为活动以及它们对陌生环境的探索行为。该实验在一个敞箱(长70 cm、宽50 cm、高40 cm)中进行。实验过程参考杨子玉[6]的方法，每只小鼠完成测试后，用10%的乙醇擦拭敞箱，晾干以备下次使用。

图1 建立阿尔兹海默症小鼠模型的实验方案和 BEO处理的实验流程Fig.1 Experimental protocol for establishing a mousemodel of Alzheimer’s disease and drugadministration for BEO treatment

1.8 Y-迷宫实验

参考刘树柏[7]的方法进行Y-迷宫实验，并进行了些许改动。Y-迷宫是一个等边三角形区域。实验最初，关闭3号臂并将3号臂记为新异臂。实验开始时小鼠被放置在1号臂，让小鼠在迷宫中自由探索5 min。1 h后，3号臂被打开，让小鼠从1号臂开始自由移动5 min。实验时记录这5 min内小鼠进入各个臂的顺序和次数。自发交替行为是指在测试中连续进入3个臂。自发交替行为的百分比(percentage of spontaneous alternation，SAP)计算公式如下：

每次测试后，用10%的乙醇仔细擦拭Y-迷宫。

1.9 血清和脑组织匀浆的制备

行为实验完成后，取眼球血并在4 ℃下以3 000 r/min离心2 min，分离出血清。此外，在行为学实验结束后，立即从死亡小鼠身上剥离出大脑。将大脑置于生理盐水中，以去除血细胞，在滤纸上印迹，并在-80 ℃下冷冻。前额叶皮层和海马结构在冰上进行解剖，并在液氮中冷冻。样品保持在-80 ℃直到进行检测。

1.10 小鼠血清以及脑组织中生化指标的检测

按照所对应的试剂盒说明书测定小鼠血清中MDA含量和SOD活性。

酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠脑组织小鼠大脑中Aβ、AchE、IL-1β、IL-6和TNF-α含量。

1.11 统计分析

本试验各组样本数为7，数值均以“平均值±标准差”来表示。柱状图使用Graphpad Prism 7.0进行分析与绘图，分析时采用ANOVA单因素进行方差分析，并采用多重检验的方法检验数据的差异显著性。使用IBM SPSS Statistics 26软件进行ANOVA单因素方差分析，并采用Duncan’s法检验数据的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 佛手柑精油成分的测定结果

运用GC-MS测定实验所用的佛手柑精油，检测到29种香气物质。采用峰面积归一化法进行相对定量的计算，求得各个化合物在佛手柑精油中的相对含量，结果如表1所示。所鉴定出的29种成分,其中有13个烯烃类化合物，总相对含量为44.30%，为佛手柑精油的主要香气成分；有7个酯类化合物，总相对含量为20.06%；有3个醇类化合物，总相对含量为9.19%；有4个醛类化合物，总相对含量为2.25%；1个酮类化合物，总相对含量为0.02%；其他1种占0.08%。由表1可知，该BEO的主要成分是萜烯类以及酯类、醇类、醛类、酮类等多种生理活性物质，其中含量最高的是D-柠檬烯，占18.94%，可能它在改善D-gal和AlCl3导致的认知障碍方面起了主要作用。

表1 佛手柑精油的化学成分及相对含量 Table 1 Chemical composition and relative percentage content of bergamot essential oil

2.2 BEO对D-gal和AlCl3诱发的OFT焦虑感的影响

在嗅闻佛手柑精油21 d后，对各组小鼠的焦虑行为进行了评估。图2显示了OFT中小鼠焦虑行为的结果。与对照组相比，接受D-gal和AlCl3诱导处理的组在水平跨越格子数和直立次数上显著减少(P<0.05)，表明接受D-gal和AlCl3处理的动物在OFT中有类似焦虑的行为。与模型组相比，嗅闻BEO 1 h处理组的水平跨越格子数和直立次数显著增加 (P<0.05)，这表明BEO减弱了D-gal和AlCl3诱导的焦虑样行为，提高了小鼠的活泼程度和好奇程度。另外，嗅闻1 h组和2 h组在直立次数具有显著差异，说明在提高小鼠的好奇程度上，嗅闻1 h佛手柑精油比嗅闻2 h的效果更好。阳性对照组的水平跨越格子数和直立次数没有显著增加，可能是盐酸多奈哌齐致恶心、烦躁不安的副作用[8]影响了小鼠的情绪。

2.3 BEO对D-gal和AlCl3引起的空间记忆损害的作用

如图3所示，在Y-迷宫测试中各实验组自发交替百分比(图3A)和进入新臂的次数(图3C)均显著下降，其中模型组小鼠下降最多，下降幅度分别达到45%和36%。阳性对照组小鼠在连续21 d口服标准药物的盐酸多奈哌齐(2 mg/kg)后，自发交替百分比显著上升42%，证明盐酸多奈哌齐对该模型的认知障碍具有改善作用。所有治疗组之间的交替现象均有显著提高，但1 h和2 h嗅闻组间无显著性差异。与正常组相比，交替百分比最低的是模型组，最接近正常水平的是阳性对照组。结果见图5。图3B中各组小鼠总进臂数无显著差异。图3C中模型组和实验组小鼠进入新臂的次数显著减少，但经过嗅闻BEO 2 h后进入新臂的次数得到了很大的改善。

差异性用“*”(P<0.05)和 “**”(P<0.01)表示。下同。Differences are indicated by “*” (P<0.05) and “**” (P<0.01). The same as below.

图3 吸入 BEO(1 h和 2 h)对自发交替百分比(A)、总进臂数(B)和进入新臂的次数(C)的影响Fig.3 Effects of the inhaled BEO (1 h and 2 h) on the percentage of alternation (A) and onthe number of entry arms (B) and on the number of entries into the new arm (C) in the Y-maze task

2.4 嗅闻BEO对氧化应激标志物的影响

与对照组相比，腹腔注射D-gal和AlCl3导致MDA水平显著增加(P<0.01)(图4A)。与模型组相比，盐酸多奈哌齐和精油嗅闻组的MDA水平分别下降18%、34%和44%(P<0.05)。

此外，与对照组相比，模型组小鼠脑组织中的SOD水平明显下降(图4B)。相反，与模型组相比，吸入佛手柑精油2 h后，小鼠脑组织中的SOD明显增加。盐酸多奈哌齐处理组和1 h嗅闻组与模型组两两相比均没有明显差异。

另外，我们还测试了小鼠海马和皮层中的GPX(图4C和4D)。经过D-gal和AlCl3处理的小鼠海马中GPX含量显著下降，但是精油吸入处理未能起到明显的改善作用。类似地，与对照组相比，小鼠皮层中的GPX含量也显著下降。与海马中GPX结果不同的是精油吸入1 h和2 h均能够显著提高GPX含量，分别提高了33%和17%。

图4 吸入BEO(1 h和2 h)对D-gal和AlCl3处理的小鼠血清中的MDA(A)和SOD(B)水平及小鼠海马(C)和皮层(D)中GPX的影响Fig.4 Effects of inhaling BEO (1 h and 2 h) on the levels of MDA (A) and SOD (B) in the serum and the levels of GPX in hippocampal (C) and cortex (D) of D-gal and AlCl3-treated mice

2.5 吸入精油对阿尔兹海默症模型小鼠脑内Aβ含量的影响

图5显示了各组小鼠脑组织Aβ含量的不同。与正常组相比，模型组小鼠海马中Aβ含量显著增加(P<0.05)；与模型组相比，阳性对照组和嗅闻组中Aβ含量均显著下降，其中2 h组最低，1 h组次之，最后是阳性对照组。这表明小鼠在嗅闻2 h佛手柑精油后降低Aβ沉积的效果最好。

2.6 吸入佛手柑精油对阿尔兹海默症模型小鼠脑部炎症因子的影响

表2显示了小鼠海马中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平。与对照组相比，D-gal和AlCl3显著提高了海马中的IL-1β、IL-6和TNF-α(P<0.05)水平，分别提高了83%、38%和71%。与模型组相比，1 h和2 h嗅闻均显著降低了海马中IL-1β和TNF-α (P<0.05)的水平，从而显著降低了炎症反应，且吸入精油2 h显示出更好的效果。

图5 吸入BEO(1 h和2 h)对D-gal和AlCl3处理的小鼠脑部Aβ水平的影响Fig.5 Effects of the inhaled BEO (1 h and 2 h) onthe Aβ level in the D-gal and AlCl3 treated mice

表2 吸入BEO(1 h和2 h)对D-gal和AlCl3处理的小鼠脑部AchE水平的影响 Table 2 Effect of BEO inhalation (1 h and 2 h) on AchE levels in the brains of D-gal and AlCl3-treated mice 10-12 g/mL

2.7 吸入佛手柑精油对阿尔兹海默症模型小鼠胆碱功能的影响

脑组织的生化分析显示，与对照组相比，模型组海马和皮层组织中的AchE活性显著提高(P<0.01)(图6)，而与模型组相比，精油处理显著降低了皮层的AchE活性(1 h为P<0.01，2 h为P<0.01)，且精油处理2 h作用更为显著。因此，吸入精油减少了D-gal和AlCl3给药后产生的胆碱功能障碍，从而在Y型迷宫和旷场实验中表现出更大的促进作用。

图6 吸入BEO(1 h和2 h)对D-gal和AlCl3处理的小鼠海马(A)和大脑皮层(B)中AchE水平的影响Fig.6 Effects of the inhaled BEO (1 h and 2 h) on the AchE level in hippocampus(A) and cortex(B) in the D-gal and AlCl3 treated mice

3 讨 论

本研究检测了小鼠在OFT和Y-迷宫中的表现，仅与对照组和实验组相比，模型组小鼠出现了探索能力和短期记忆指数下降等行为障碍。经过D-gal和AlCl3处理后的小鼠脑中Aβ含量显著升高，也证明了小鼠出现了阿尔兹海默症的病理性症状。然而，在吸入BEO后，认知功能显著恢复，Aβ含量也有所降低。Rombolà等[9]也利用OFT和强迫游泳等实验证明了注射佛手柑精油可以减轻大鼠焦虑行为。这种整体影响可能归因于其对神经的保护能力。为进一步探究BEO对AD小鼠神经保护的机制，笔者进行了有关氧化应激和炎症因子指标的检测。

酶抗氧化剂如过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)以及红细胞状态和血浆中总抗氧化水平的变化，可以作为患有AD患者大脑病理特性的指标[10]。通过测量不同组血清和脑组织中MDA、SOD、GPX水平来确定不同组小鼠的体内氧化应激水平。有研究表明长期注射D-gal会导致代谢紊乱，导致体内活性氧的增加；铝会诱导突触囊泡和轴突线粒体周转的减少，导致神经元氧化产物的释放[11]。在本研究中，模型组小鼠的MDA含量显著上升，SOD和GPX含量显著下降，从而表明脑组织内自由基增加。然而，吸入佛手柑精油显著降低了MDA含量，并提高了SOD和GPX的含量，使氧化应激的程度降低。这一发现与另一项研究相一致，该研究表明口服长叶薄荷挥发油通过抗氧化(SOD，GSH)和抑制NO和脂质过氧化水平，显著改善了AlCl3导致的氧化应激[12]。

由于AD的确切病因仍然难以捉摸，有越来越多的证据表明神经炎症也参与了AD的发生。许多促炎细胞因子，如IL-1β、IL-6和TNF-α，都是神经炎症的关键因素[13]。在目前的研究中，D-gal和AlCl3增加了海马中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，表明大脑区域存在严重的神经炎症情况。本研究结果与其他研究一致[1,14-16]，表明负责小鼠认知的海马在接受D-gal和AlCl3腹腔注射后受炎症刺激影响。这也与BEO被发现可以通过抗氧化剂、抗炎剂和GABA调节的联合作用来缓解AlCl3诱导的大鼠的焦虑行为相似[17]。

胆碱系统也在AD过程中起着重要的作用。AchE是催化胆碱能神经递质水解的酶，在与铝相互作用时增强活性[18]，且Aβ对乙酰胆碱(acetylcholin，Ach)的合成和释放有不利影响[19]，共同解释了D-gal和AlCl3处理组AchE活性的升高。然而，吸入佛手柑精油抑制了AchE活性的升高，尤其是嗅闻2 h 组的抑制性更为显著。大量研究证明了植物精油的AchE抑制活性。Tundis等[20]研究发现柑橘精油具有抗体外AchE活性。Sadiki等[21]研究发现吸入Tetraclinisarticulata精油能够通过调节AchE的作用，改善Aβ42导致的记忆缺陷。因此，BEO能够降低D-gal和AlCl3给药后产生的胆碱功能缺陷，从而增强了Y-迷宫和OFT中的益智效应。

上述结果证明了BEO具有抗炎等作用，从而在阿尔兹海默症模型小鼠中发挥作用，但是BEO作为一种复杂的化合物，具体是哪种气味物质起到了作用还不明确。值得注意的是，柠檬烯的抗氧化和抗炎活性已被证明其对Aβ42毒性的保护作用至关重要[22-23]。Boiangiu等[24]发现柠檬烯能减少氧化应激生物标志物如丙二醛(MDA)，以及增加超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶和谷胱甘肽(GSH)的含量，从而提高大鼠的认知功能。另外，也有研究表明芳樟醇也对阿尔兹海默症有积极作用。芳樟醇被认为可以保护神经元免受毒性和损伤，从而对阿尔兹海默症有积极的治疗作用。据报道，慢性芳樟醇可以减轻AD3xTg-AD三转基因小鼠模型的记忆丧失和情绪损伤[25]。Caputo等[26]通过细胞实验发现芳樟醇可以通过抵消Aβ42低聚物诱导的Ca2+稳态的失调来缓解Aβ42的神经毒性。因此，我们初步猜测是佛手柑精油中的柠檬烯和芳樟醇起到了积极作用，能提高认知功能，改善D-gal和AlCl3模型小鼠的认知功能障碍。

综上所述，嗅闻2 h后的阿尔兹海默症小鼠表现出更好的神经保护作用，达到了提高认知能力和探索能力的作用，这可能是更长时间的嗅闻使得精油中的有效成分在脑中积累的更多，从而更能发挥出保护作用。分析表明佛手柑精油在吸入后是通过减少小鼠脑中Aβ的沉积，抑制氧化应激、炎症因子和胆碱酯酶水平来起到神经保护的作用，从而使得小鼠在旷场实验和Y-迷宫实验中探索能力和认知能力显著增强。