静电场轨道阱质谱在水中溶解性有机质表征中的应用进展

王书越, 何洪源*, 饶 竹, 石喆元,孟建卫, 王立平, 李开开

1)中国人民公安大学侦查学院, 北京 100038;2)自然资源部生态地球化学重点实验室, 国家地质实验测试中心, 北京 100037;3)河北省矿产资源与生态环境监测重点实验室, 河北保定 071000

溶解性有机质(Dissolved Organic Matter, DOM),是一类组成、结构高度复杂、具有异质性的有机混合物, 广泛存在于各种天然水体中(Hertkorn et al.,2007; Tremblay et al., 2007; 李超群等, 2018; Mangal et al., 2020; Zhang et al., 2021)。DOM是连接生命形态碳和无机碳的关键纽带, 参与各种生物地球化学循环过程, 被认为是陆地生态系统和水生生态系统中一种重要的活跃化学组分(吴丰昌等, 2008;Melendez-Perez et al., 2016; Fox et al., 2017)。研究表明, DOM包含上千种化合物, 官能团多、质量范围广, 含量虽少, 却影响着有毒重金属和有机污染物的迁移转化和生物有效性(楼涛等, 2004; Raeke et al., 2017; 谢冰心等, 2020), 引发人类健康风险。DOM 的存在还与一些地方病的发生密不可分, 例如地下水中高腐殖酸会使水溶性硒含量减少, 降低硒的生物利用率(曹静祥等, 1993; 韩立新和曾宪成,2009), 导致大骨节病的发生(中国科学院地理研究所环境与地方病研究组, 1988; 王婧等, 2020)。此外,水中富营养化、有毒溶解性有机质混入均可造成水体污染。

虽然DOM在生物地球化学作用过程中、在生物有效性、水体安全性等方面具有重要作用, 但由于DOM具有组成复杂、含量较低、与水的互溶性强等特征, 常规检测技术难以对其分子组成进行精准解析, 限制了研究人员对DOM作用的深入认识。现有 DOM 常规表征技术以光谱技术为主, 包括傅里叶变换红外光谱(Zhang et al., 2009)、紫外-可见吸收光谱(Birdwell et al., 2010; 张博等, 2020)、三维荧光光谱(Riley et al., 2018; 王翔等, 2020; 张博等,2020)等。这些技术利用DOM中不同物质结构、官能团、发色基团、荧光基团各不相同的特性, 揭示了 DOM 主要的化合物类型, 如腐殖酸、富里酸、氨基酸等。但光谱技术只能揭示部分DOM的宏观特性, 无法描述其分子组成。

随着质谱技术的发展, 高分辨质谱(High Resolution Mass Spectrometry, HRMS)的分辨率可以达到100 000 (m/z 400)以上, 能够表征DOM的分子组成(Hertkorn et al., 2008; Riedel and Dittmar,2014), 是解析DOM的理想方法。自1997年Fievre et al.(1997)首次采用HRMS检测DOM以来, 各类高分辨质谱仪检测DOM的研究报道大幅增长。傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry, FT-ICR MS)、静电场轨道阱质谱仪(Orbitrap MS)和飞行时间质谱仪(Time-of-Flight MS, TOF MS)的普及促进了 DOM 解析技术的提升(Cortes-Francisco et al.,2011; Hawkes et al., 2016; Lu et al., 2018; Aguilar-Alarcon et al., 2020; Pan et al., 2020)。

FT-ICR MS技术是表征DOM最常用的HRMS技术(Kujawinski, 2002; Hertkorn et al., 2007)。由于该仪器体积庞大、操作复杂、仪器及维护成本高, 在一定程度上限制其广泛应用(Zhurov et al., 2013;Simon et al., 2018)。近几年, 研究人员通过探索和实践、证实了高分辨Orbitrap MS能够满足DOM分子组成分析的技术需求(Hawkes et al., 2016; Pan et al.,2020)。Orbitrap MS技术与利用液氦维持超导磁场的FT-ICR MS不同, 它使用轴向谐波轨道阱作为质量分析器, 仪器和维护成本相较于FT-ICR MS大幅下降(Makarov et al., 2006a, b)。同时兼具高分辨率、高灵敏度、高通量、高扫描速率等特性(Zubarev and Makarov, 2013; 栗则等, 2018), 取得了与 FT-ICR MS相似的解析效果, 为推动溶解性有机质的精细解析的普及提供了可能。本文总结了DOM高分辨质谱数据表达方法, 综述了 Orbitrap MS技术的发展及其表征水体中 DOM 的应用现状, 并对未来研究进行展望。

1 Orbitrap MS技术

Orbitrap质量分析器起源于1923年轨道捕获原理的实现(Zubarev and Makarov, 2013)。随后, 弯曲线性阱(C-trap)的发展有效将Orbitrap质量分析器与离子源、离子传输装置分离, 使任何离子源和离子传输装置都可以与 Orbitrap质量分析器相连,扩大了Orbitrap MS的应用范围。如图1所示, 在C-trap中, 随着离子被捕获, 射频电压迅速下降,离子在高纯氮气的作用下减速, 同时在垂直于C-trap弯曲轴的方向施加直流电压, 使离子聚集压缩到C-trap弯曲部分的出口(对着Orbitrap质量分析器入口), 被Orbitrap质量分析器的电场吸入。当离子进入 Orbitrap质量分析器时, 通过提升中心电极电压的绝对值增加场强, 产生向心吸引力, 限制离子轴向运动, 而改作圆周运动(Hu et al., 2005)。第一台商用仪器是由Thermo Electron公司(现为Thermo Fisher Scientific公司)推出的LTQ Orbitrap Classic;2008年, 名为Exactive的Orbitrap质谱仪建成, 其离子源直接与C-trap相连; 2011年, 该仪器与四极杆质量分析器相结合, 并以Q Exactive的名称推出,从此这类先进的Orbitrap质谱仪逐渐在高通量筛查方面流行起来(Zubarev and Makarov, 2013)。Q Exactive Orbitrap MS的结构如图2所示。

图1 C-trap和Orbitrap质量分析器的横截面(Zubarev and Makarov, 2013)Fig. 1 Cross-section of the C-trap and Orbitrap analyzer (Zubarev and Makarov, 2013)

图2 Q Exactive Orbitrap MS的结构图Fig. 2 Structure of Q Exactive Orbitrap MS

自2005年Orbitrap MS商业化以来, 其分辨率从原来的150 000提高到450 000 (m/z 200), 可满足表征 DOM的要求(Hu et al., 2005; Zhurov et al.,2013; Zubarev and Makarov, 2013)。研发人员还在C-trap之后增加一个碰撞单元, 开辟了利用高能碰撞裂解离子的新途径(Zubarev and Makarov, 2013)。该裂解模式与传统的碰撞诱导解离一样, 可用于解析DOM的具体分子结构。此外, Orbitrap MS在表征低分子量(Low Molecular Weight, LMW)化合物方面表现出优越的能力, 已被用于表征各种来源的DOM(Cortes-Francisco and Caixach, 2013; Mangal et al., 2016; Phungsai et al., 2016)。同时, 高扫描速率能使其与液相色谱串联, 从而实现在线分离和表征DOM(Patriarca et al., 2018)。

2 Orbitrap MS技术对水体中DOM的表征

2.1 Orbitrap MS数据表达

采用Orbitrap MS技术对水体中DOM分析会产生数千个质量峰, 为简化数据和直观表达 DOM 的分子组成, 通常进行分子式分配和可视化分析。

2.1.1 分子式分配

分子式分配是指计算机程序根据预定义的化学约束条件, 对每个检测到的质量峰计算其可行的元素组成。Koch et al.(2007)解释了利用高分辨质谱数据对SRFA标样中DOM进行分子式分配的基本原理, 并表明随着质量增加, 如果将无氧杂原子加入计算, 分配的分子式数量会急剧增加。Herzsprung et al.(2014)从化学角度提出了一种解释和改进分子式分配的新方法, 首先在标称质量内搜索质量峰的多个分子式并分组(如 CHO/CHON2), 然后分析它们的等效双键数减氧原子(DBE-O)的频率条形图,该方法的主要优点是可以同时对多个m/z值进行分组分配。目前, 常用的分配规则包括设置响应值的最低限, C、H、O、N、S等元素个数和元素比例的范围, 以及出现多个候选分子式时如何确定最优解。

随着研究的深入, 基于复杂搜索算法的分子式分配自编程软件的报道越来越多(Fu et al., 2020)。除了商业软件(如PetroOrg (Blackburn et al., 2017)、MIDAS分析(Cook et al., 2017)等), 还有仪器自带的软件(如MassCalc (Yassine et al., 2014))和自动代码(如 UltraMassExplorer (Leefmann et al., 2019)、WHOI 代码(Kujawinski and Behn, 2006)等)已被开发并用于高通量分子式分配。最近, Fu et al.(2020)开发了两个开源性算法(TRFu和FuJHA), 将不同来源DOM的多个高分辨质谱数据进行自动分子式分配, 经过准确性评估, 该算法可有效得出分子式。

2.1.2 可视化方法

常用的DOM分子组成可视化方法有范克莱恩图(Van Krevelen Diagram, VK图), 肯德里克质量偏差图(Kendrick mass defect plot, KMD图), DBE vs C图和DBE vs O图等。

VK图是对元素数据(C、H、N和 O)进行图形化和统计化处理的方法, 最常见的是根据每个化合物分子式的 O/C和 H/C比值绘制的二维图。2003年, Kim et al.(2003)首次将该方法用于水中DOM分子组成的可视化分析。由于自然生物分子具有相对统一和离散的元素组成, 因此不同类型的分子可通过其O/C和H/C比值的某种组合来进行分类。目前,常采用 Hockaday et al.(2009)研究的分区方法对水中 DOM 的分子组成进行分类, 包括脂类, 不饱和烃类, 稠环芳烃类, 蛋白类, 木质素类和碳水化合物类。

Kendrick质量偏差分析是同源化合物对复杂质谱中的峰进行分类, 已成功应用于高分辨质谱数据(Kendrick, 1963)。对于结构单元一致(如CH2, COOH,CH2O等)而质量不同的化合物组成(结构单元呈整数倍关系), 可以通过二维图像呈现, 即 KMD图。由于同源相关的化合物位于同一纵坐标值的水平线上, 因此可以直观了解 DOM 中化合物的类型及其分子量分布范围。在KMD图中, 横坐标为Kendrick质量(Kendrick Mass), 纵坐标为Kendrick质量偏差(Kendrick Mass Defect, KMD), 相关计算公式如下：

(1)式中, F为结构单元, 可以是CH2, COO, H2,H2O等。

等效双键数(Double Bond Equivalent, DBE)代表化合物的不饱和度, 通过表观DBE与C的关系或DBE与O的关系, 可以补充对DOM分子组成的认识和理解。此外, 其他可视化方法也可以为更全面解析DOM的分子组成提供参考。

2.2 水体中DOM分子组成的表征

近年来, 采用 Orbitrap MS技术表征水体中DOM 分子组成的报道逐年增多。研究人员在探究Orbitrap MS表征DOM分子组成方面主要集中在表征方法的准确性、重现性和代表性等问题。Remucal et al.(2012)首先采用截留分子量在100～500之间的透析膜对 Suwannee河黄腐酸(Suwannee River Fulvic Acid, SRFA)标样进行透析, 再用紫外-可见吸收光谱和Orbitrap MS对透析液和保留液进行分析。通过与 FT-ICR MS的分析结果进行比较,Orbitrap MS的质量精度满足检测复杂混合物中质量<600 Da化合物分子式的需要, 当分子量在100～200 Da时Orbitrap MS仪器响应最强。同时, 该研究证实SRFA中包含低分子量化合物。Hawkes et al.(2016)采用 LTQ-Orbitrap MS技术表征北太平洋海水样本和瑞典Plåten湖水样本中的DOM, 就检测的分辨率、数据获取时间、分子质量分布和结果重现性等方面与 FT-ICR MS进行了比较。结果表明Orbitrap MS重现性好, 平行样本间Bray Curtis相异度为2.85±0.42%(平均±标准偏差)。随后, Hawkes联合了各国的科研组(2020)考察了不同实验室间使用不同HRMS检测结果之间的差异。该实验采用了统一制备的 4种 DOM 参考样本, 即 SRFA、Suwannee河天然有机物(Suwannee River Natural Organic Matter, SRNOM)、Pony 湖黄腐酸(Pony Lake Fulvic Acid, PLFA)和Elliot土壤黄腐酸(Elliot Soil Fulvic Acid, ESFA), 分别在 16个实验室共 17台HRMS仪(其中包括 7台 Orbitrap MS仪)上进行检测。结果发现, 不同仪器检测出 DOM 的氢饱和度和芳香度基本一致, 而平均分子质量和氧含量受仪器类型和参数设置的影响较大。最终, 研究人员针对四种样本提出了四个不同参数的度量值, 以便用于评估HRMS的仪器性能。2020年, Pan et al.(2020)针对 SRFA和 SRNOM 样本, 将 Orbitrap MS与FT-ICR MS在分辨率、质量分布、检测动态范围和同位素峰强度比等方面进行了全面的比较, 同时考察了不同质谱参数对检测结果的影响。结果表明,高分辨Orbitrap MS是一种很好的DOM分子组成表征技术。

除了考察Orbitrap MS表征DOM标样分子组成的能力, 研究人员还对不同的实际水体样本进行了检测。Cortes-Francisco and Caixach(2015)采用Orbitrap MS对西班牙巴塞罗那海岸收集的海水中DOM 进行了碰撞诱导解离高分辨串联质谱分析,通过对其单个产物离子质谱重构, 将多个片段划分到不同的前体离子上, 表明存在羧基、羟基、醌类和脂类, 并且结构与木质素类降解分子相似。该结果证实了海水中DOM具有高度多样性的官能团。李利杰等(2019)采用 Orbitrap MS/MS分析得出了SRFA、不同陆源水体、近海海水和深海海水的串联质谱碎片, 结果表明, 不同水体中 DOM 分子结构具有相似性, 约75%～90%的碎片离子相同, 而差异性主要是因为不同来源的 DOM 分子组成不同。Kasuga et al.(2020)采用Orbitrap MS对日本11个主要湖泊中的 DOM 进行了表征, 经分子式分配, 得到了845～1451种化合物组分, 其中555种组分在所有湖泊中普遍存在。同时利用皮尔逊相关性探究了这些共同组分的相对峰强度与水质指标(紫外吸光度、可溶化学需氧量、三卤甲烷生成势)之间的关系,为水质管理提供信息。

由于 DOM的组成非常复杂, 直接采用 HRMS分析会导致许多化合物同时电离, 形成电离抑制,使得质谱数据中同分异构体的信息被覆盖, 无法分辨是哪种化合物产生了响应。为了更全面表征水体DOM的分子组成, 近几年, 研究人员将高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)与 Orbitrap MS结合, 在质谱分析前先通过化合物极性的差异对 DOM 进行色谱分离, 该方法大大提高了解析 DOM 分子组成的水平。Patriarca et al.(2018)开发了一种在线 HPLC-Orbitrap MS表征DOM 的新方法, 将每个样本的色谱分成 7段(每 4分钟为一段, 第一段为3分钟), 该方法简单、快速、重现性好(Bray-Curtis相异度在 2.5%左右), 总体上分配了更多的分子式。与直接注入质谱分析相比,该方法增加了极性信息, 但没有增加太多的分析时间。将该方法应用于北太平洋的海水样本、瑞典某个湖水样本和 SRFA, 提升了原有的分析能力。Wunsch and Hawkes(2020)将平行因子分析(PARAFAC)等化学计量学方法应用于瑞典东南方74个河流样本的 HPLC-Orbitrap MS检测得到的DOM数据集, 将该数据集包含的7178个质量峰和分配的1355个分子式, 根据保留时间分成五组, 表达了96.89%的数据, 其余的变化由矩阵效应和测量噪声构成。之后, 采用PARAFAC对共洗脱的分子进行区分。本研究将色谱分离与化学计量学方法结合, 虽然引入了额外的数据分析步骤, 但提供了更好的信息恢复, 并最大限度地提高了 HPLC-HRMS分析的潜力。Farré et al.(2019)采用 LTQ-Orbitrap MS对不同来源的饮用水进行直接输入和色谱分离分析, 研究 N-亚硝基二甲胺(NDMA)的形成与DOM 分子指纹图谱的关系。结果表明, 与 NDMA的形成呈正相关的化合物主要对应于VK图中脂肪族、肽类和类脂类化合物(H/C≥1.5)的区域。本研究中, 尽管色谱分离不能更好地定义 NDMA的前体,因为它们存在于色谱图的不同馏分中, 但所提出的方法有助于缩小通过非目标分析寻找天然存在的NDMA前体的范围。

2.3 水体中DOM分子组成变化的表征

水体中DOM分子组成的变化反映了水体中元素的生物地球化学特征, 掌握 DOM 分子组成变化是了解水域生态系统信息的关键。研究表明, DOM对饮用水的净化处理过程可造成某些不利影响, 如可降低水质, 增加对混凝剂、氧化剂和消毒剂的使用需求等。DOM还被认为是一种有机前体, 可导致臭氧化过程中氧化副产物(Oxidation Byproducts,OBPs)和氯化过程中消毒副产物(Disinfection Byproducts, DBPs)的产生, 对人体产生危害。为监测DOM 分子组成的动态变化, 对饮用水净化过程提供指导建议, 目前, Orbitrap MS技术在表征水体中DOM 分子变化的应用主要集中在对饮用水库或污水处理厂水体的研究。

2018年, Phungsai et al.(2018)采用Orbitrap MS未知物筛查方法, 对两个饮用水处理厂在水处理过程中 DOM 的分子组成进行了研究。结果表明, 臭氧反应对 DOM 分子组成影响最大, 臭氧处理降低了低饱和含 CHO类 DOM 的峰强, 增加了饱和OBPs的峰强和数量。经氯化处理后, 检测到50多个DBPs, 其中至少一半是未知的。2019年, 该研究组(Phungsai et al., 2019)采用Orbitrap MS未知物筛查方法, 研究了近千种 DOM 分子组成在氧化过程中(1  mg O3/L、4  mg O3/L和4  mg O3/L + 2.5 mg H2O2/L)的变化, 并探究了氯化过程对未知 DBPs形成的影响。结果表明, 臭氧处理增加了未知 DBPs的数量和峰强度, 而 O3/H2O2高级氧化处理减少了未知DBPs的生成; 其次, 不同臭氧处理会生成不同的未知DBPs。2021年, 该研究组(Phungsai et al., 2021)在先前研究的基础上, 又采用三种不同的固相萃取柱对饮用水进行连续前处理, 提供了之前未解析的DOM分子组成及变化。在DBPs前体物质的研究工作中, Sanchís et al.(2020)采用 Orbitrap MS分析了巴塞罗那流域水体氯化后DOM分子组成的变化。结果表明, 氯化处理显著改变了 DOM 分子组成, 质谱平均m/z和肯德里克质量缺陷均降低, DOM分子指纹图谱(VK图)有明显变化, 其中包括低H/C特征的出现, 大部分脂类特征的消失, 丹宁区高氧化峰(平均O/C为0.78～0.08)的出现等。同时, 在样本氯化过程中产生了657个卤化峰, 大部分在VK图的类烃缩合区和类木质素区, 有 200个特征与 DBPs的形成高度相关(p≥0.795)。

人类活动也是引起水体DOM分子组成发生变化的重要因素之一, Pemberton et al.(2020)采用固相萃取从河流和处理过的污水中提取 DOM, 并采用DI-Orbitrap MS和HPLC-Orbitrap MS进行分析。对获得的数据进行单变量和多变量统计分析, 从而对比排污口上游河流和下游河流中DOM的差异。结果表明, 下游水与排污口废水中 DOM 分子组成相似, 与上游水中 DOM 有明显差异, 证实了人类活动所排放的物质可以显著改变河流DOM的分子组成。另外, 通过在线数据库检索二级质谱, 对主要化合物进行了鉴定, 为人类源化合物的鉴定提供了依据。该方法对评估河流系统中任何点源的 DOM分子组成差异, 或由生物、季节、人类活动等外界环境改变导致的DOM分子组成差异方面具有重要的价值。近年来, 快速城市化导致封闭水体的有机污染, 加速水体富营养化。Yuthawong et al.(2020)采用Orbitrap MS测定了日本污染最严重、富营养化程度高的Inba湖中低分子量DOM的分子组成。通过一年的监测表明, 该湖泊中 DOM 由稳定成分和季节特异性成分组成。同时, 湖泊中检测到的DOM 组分与两条入流河流中检测到的组分基本一致, 表明异源组分的季节变化可以驱动浅水湖泊中DOM 组分的变化。此外, 将高锰酸钾预处理与Orbitrap MS结合, 结果表明, 溶解性化学需氧量(DCODMn)仅由少量高度不饱和的成分构成, 揭示了富营养化湖泊中DOM的分子组成。

由于DOM参与水生生态系统的众多物理、化学、生物反应, 通过Orbitrap MS表征水体中DOM分子组成的变化, 可以间接了解水体状态, 例如,通过表征水体富营养化背景下藻华爆发-消退周期的 DOM 分子组成变化, 有助于对水体富营养化进行控制与治理; 表征污水排放前后水体 DOM 分子组成变化, 有助于了解点源输入对水体造成的影响;表征多级饮用水处理时 DOM 分子组成变化, 有助于评价饮用水处理工艺效果等。因此, 针对水体中DOM复杂的分子组成和变化, Orbitrap MS可以一定程度上进行解析, 但更为详细的分子结构、具体发生反应的分子特征等信息还有待进一步研究。

3 总结和展望

本文综述了 Orbitrap MS技术及其在水体中DOM表征中的应用现状。Orbitrap MS灵敏度高、通量大、操作简单、维护成本低, 通过与FT-ICR MS分析DOM的结果进行比较, 证实了高分辨Orbitrap MS能够满足DOM分子组成分析的技术需求。但不同实验室对水体中DOM分析的过程(前处理方法、仪器参数设置和数据分析)差异较大, 难以形成标准化; 而且采用高分辨质谱得到的 DOM 数据信息量大, 目前没有统一的方法进行数据处理; 同时现有的高分辨 Orbitrap MS应用范围窄, 限制了其快速发展。因此, 在未来的研究工作中还应不断挖掘和完善更多功能, 一是针对相同的样本, 建立普适的分析标准, 包括样本处理和制备、电离、参数设置、方法验证等; 二是针对大批量样本, 可充分利用重复样本、空白样本和质量控制, 始终监测参考样本信号的漂移以减少误差; 三是开发标准化数据处理软件, 包括扣除背景噪声、筛除无关离子、分子式分配、可视化分析等方法, 实现快速、大批量数据处理; 四是推广并应用具有高分辨软件的Orbitrap MS仪, 扩大高分辨Orbitrap MS的应用范围, 更全面的解析水体中 DOM 分子组成及分子变化, 为水质检测提供更完善的依据。此外, 还应进一步探究DOM与有毒金属、有机污染物、微量元素(如硒、砷)等物质之间的相互作用机理, 并评估对人体健康产生的风险, 为环境污染与治理提供技术支撑。

Acknowledgements:

This study was supported by China Geological Survey (Nos. DD20211414 and DD20190323), Fundamental Research Funds for the Central Universities(No. 2021JKF201), and Opening Project of Shanghai Key Laboratory of Criminal Scene Evidence (No.2021XCWZK05).