双水相体系萃取迷迭香酸工艺研究

刘康珂，陈薪宇，邓爱华，谢晓婷，刘 慧

（湖南文理学院 生命与环境科学学院，湖南 常德 415000）

迷迭香（Rosmarinus officinalis），又称艾菊，系唇形科植物，起源于地中海地区[1]，其含有的迷迭香酸（Rosemary acid）是一种天然抗氧化剂，有助于防止自由基造成的细胞受损，且广泛应用于食品、医药等领域[2]，具有抗菌[3]、抗病毒[4]、抗氧化[5]、抗癌[6]等作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

迷迭香提取物（迷迭香酸20%），湖南广源生物科技有限公司提供；聚乙二醇（PEG），无锡市亚泰联合化工有限公司提供；硫酸铵，天津市志远化学试剂有限公司提供；纯水，实验室纯水机。

1.2 仪器与设备

JB/T5374型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司产品；ZWL-LS1-10型纯水机，湖南中沃水务环保科技有限公司产品；W1100型高效液相色谱仪，大连依利特分析仪器有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 迷迭香酸标准曲线

准确称取20 mg迷迭香酸标准品，加入甲醇溶液溶解，待溶解完全后，移入20 mL的容量瓶中，配置成1 mg/mL母液。然后稀释成100，300，500，700，1 000 μg/mL标准溶液，用高效液相色谱仪检测。检测条件如下：C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，i.d，5 μm）；流动相：A为乙腈，B为4%甲酸水溶液，体积比A∶B=（70%∶30%）；柱温30℃，流速0.8 mL/min，进样量20 μL，检测波长330 nm。

以迷迭香酸标准溶液的质量浓度（μg/mL）为横坐标，对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到的线性回归方程为Y=29.348X+6 703.9，相关系数R2=0.918 9（Y为相应的峰面积；X为迷迭香酸质量浓度，μg/mL）。

1.3.2 单因素试验

控制体系总质量30 g，迷迭香水溶液5 g（迷迭香酸浓度1 g/L），依次向烧杯中加入硫酸铵、PEG、水，搅拌均匀后静置，分相后测量上下相吸光度，计算迷迭香提取液中迷迭香酸的质量浓度与提取率。分别考查PEG分子量（200，400，600，800，1 000）、PEG用量（7，8，9，10，11 g）、NH4SO4用量（2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 g）等因素对迷迭香酸提取率的影响。

式中：K——上下相迷迭香酸浓度之比；

R——上下相的相比。

1.3.3 响应面试验设计

在单因素试验的基础上，运用Design Expert 8.6.1软件中的Box-behnken试验设计原理，以PEG分子量（A）、PEG用量（B）和NH4SO4用量（C）为考查因素，以迷迭香酸的提取率为响应值（Y），设计三因素三水平的响应面分析试验。

响应面试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验因素与水平设计

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 PEG分子量对提取率的影响

PEG分子量对提取率的影响见图1。

图1 PEG分子量对提取率的影响

由图1可知，随PEG分子量增加，迷迭香酸提取率增加，当分子量为400时，提取率达到最大值；当PEG分子量继续增加时，整个双水相体系的黏度增大，阻碍了上下相之间的分子转移，对传质造成不利影响，导致分配系数下降，从而影响到提取率。

2.1.2 PEG用量对提取率的影响

PEG用量对提取率的影响见图2。

由图2可知，随着体系中PEG质量分数增加，上下相的相比R逐渐增大，上相的水合能力也随之增强，使得上相的体积也随之提高，这样有利于迷迭香酸在上相的富集，导致上相中迷迭香酸的浓度逐渐增大，分配系数K和萃取率逐渐增大。

图2 PEG用量对提取率的影响

2.1.3 NH4SO4用量对提取率的影响

硫酸铵用量对迷迭香酸萃取率的影响见图3。

图3 硫酸铵用量对迷迭香酸萃取率的影响

由图3可知，随着体系中NH4SO4用量的增加，上下相的体积差增大，分配系数与萃取率也随之上升，当质量分数超过10%后，整个双水相体系的极性增强，迷迭香酸及其水溶性的杂质位于下相，迷迭香酸萃取率出现下降的趋势。

2.2 响应面试验结果

2.2.1 Box-behnken试验设计结果

响应面试验设计中，以迷迭香酸的提取率（Y）的响应值，设计三因素三水平的试验方案。数据进行二次多元回归拟合，得到二次回归方程：

Box-behnken试验设计与结果见表2，回归方差分析见表3。

表2 Box-behnken试验设计与结果

由表3可知，该模型p<0.05，具有显著性，且PEG分子量（A）和PEG用量（B）为极显著因素（p<0.01）。比较F值可得出，影响迷迭香酸的萃取率的因素强弱顺序依次为PEG分子量>PEG用量>NH4SO4用量。

表3 回归方差分析

2.2.2 交换影响分析

PEG分子量与PEG用量交互影响响应曲面及等高线图见图4。

由图4可知，PEG分子量与PEG用量之间的交互作用显著，对迷迭香酸的提取率有较大影响。迷迭香酸的萃取率随PEG用量升高而缓慢上升，随PEG分子量增大而缓慢下降。当PEG的分子量为400，PEG用量为10 g时，迷迭香酸的萃取率最高。

图4 PEG分子量与PEG用量交互影响响应曲面及等高线图

PEG分子量与NH4SO4用量交互影响响应曲面和等高线图见图5。

由图5可知，迷迭香酸的提取率随聚乙二醇分子量增大而缓慢下降，与NH4SO4用量之间呈正态分布；当PEG的分子量为400，NH4SO4用量为3 g时，迷迭香酸的提取率最高。

图5 PEG分子量与NH4SO4用量交互影响响应曲面和等高线图

PEG用量与NH4SO4用量交互影响响应曲面和等高线图见图6。

图6 PEG用量与NH4SO4用量交互影响响应曲面和等高线图

由图6可知，迷迭香酸提取率与NH4SO4用量之间呈正态分布，随PEG用量升高而呈缓慢上升趋势。PEG用量为10 g，NH4SO4用量为3 g时，迷迭香酸提取率最高。

2.3 最佳提取工艺

通过Design Expert软件Box-behnken试验设计的结果表明，当PEG分子量为400，PEG用量为10 g，NH4SO4用量为3 g时，迷迭香中迷迭香酸的提取率可达95.74%。

3 结论

采用聚乙二醇-硫酸铵双水相体系萃取迷迭香提取物中的迷迭香酸，通过单因素试验和响应面法优化萃取工艺。结果表明，当体系总质量为30 g，迷迭香酸水溶液5 g，PEG分子量为400，PEG用量10 g，NH4SO4用量3 g时，迷迭香提取物中迷迭香酸的提取率可达95.74%。