拉曼光谱技术在病原微生物检测中的应用

刘风翔，何 帅，张礼豪，黄 霞，宋一之

中国科学院苏州生物医学工程技术研究所医用检验技术研究室，江苏 苏州 215163

引 言

微生物在自然界中广泛存在，具有个体小、分布广、种类多、生长繁殖速度快等特点，在食品、医药、工农业、环保等诸多领域扮演着重要角色。随着基因组学、结构生物学、聚合酶链式反应(PCR)技术以及显微技术等学科与技术日益成熟，微生物的研究价值越发凸显。在几万种微生物中，只有一少部分微生物会造成人和动物感染继而引发疾病，这部分微生物被称为病原微生物，由病原微生物感染而引发的疾病在临床医学领域极为常见[1]。由于其种类具有多样性，加之不时出现新的病原体，给临床诊断带来了巨大困难[2]。抗生素是治疗感染性疾病的重要药物，它的发现有效控制了病原微生物的感染，挽救了数以亿计的生命[3]。与此同时，抗生素的长期使用和滥用会使病原菌的药物敏感性降低，甚至消失。微生物检验是对感染性疾病进行临床诊断的重要依据，传统的临床病原菌诊断主要依赖于细菌培养。这种检验方法耗时较长，在无法快速鉴别致病菌及检测其药物敏感性的情况下使用抗生素，加速了病原菌耐药性的产生，甚至导致耐药菌株不断蔓延传播。有研究指出：2000年至2015年期间，各国平均抗生素消费率从每天每1千名居民16.4次已增长至20.9次[4]。由于抗生素的滥用，导致了对多种抗生素耐药的“超级细菌”产生，并且已经在世界范围内广泛传播。世界卫生组织在2016年引用Mullard[5]的报告指出，因耐药细菌感染导致死亡人数约每年70万例，至2050年，每年将有超过100万人死于耐药菌感染。尽管围绕病原微生物检测的技术已有大量的研究报道，但目前已有的检测方法尚不能实现对其进行快速准确的检测。因此，病原微生物的高灵敏度无损检测与鉴定一直都是微生物相关行业的主要研究方向。

拉曼光谱技术是一种对样品进行原位、非侵入性、无标记的检测技术，可快速、无损地对单个细胞进行表征及鉴定。通过对特定光谱信息进行识别，可以高特异性的对细胞内分子变化进行监测，同时由于水几乎没有拉曼峰，对检测结果干扰性极小，因此该技术非常适合用于生物医学领域的研究[6]。拉曼光谱在单细胞水平上提供了微生物细胞中不同生物分子的指纹图谱信息，通过这些信息可以确定微生物的种类、生理特征和突变表型等。此外，拉曼光谱技术对样本的状态没有限制，固态、液态、气态样本均可以进行精准检测，且可以对微量样本进行检测，可用于鉴别生物组织微小变化。

本文对病原微生物检测技术及现状进行调研分析，简单概述了拉曼光谱技术的原理，并在文章第四部分进一步对拉曼光谱技术在病原微生物检测中的研究进展展开讨论，就其在微生物检测领域的发展前景进行了展望。

1 病原微生物检测的意义及现状

传统的临床微生物检测方法通常需要数个小时，极大降低了临床病原微生物的快速检测和鉴定的有效性与实用性。由于广谱抗菌药物的滥用，病原微生物的耐药率逐年递增[7]。

在实际的临床检验中，病原微生物的分离、鉴定均需要培养，而培养时间往往需要数天，甚至数周。并且有些病原微生物的培养条件极其苛刻，甚至无法被培养[2]。所以，微生物快速精准检测是临床医学重要研究方向。

目前，主要的病原微生物检测方法包括分子遗传学、表型鉴定法和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测法(MALDI-TOF)等。分子遗传学鉴定法可以达到核酸层面的鉴定，它主要针对的是质粒DNA或病原菌染色体的检测，包括碱基含量测定、基因芯片、聚合酶链式反应、核酸分子杂交以及全基因组测序等[8]。这些方法都有各自独特的优点，但存在检测过程中不稳定、检测结果容易受外界条件干扰、检测步骤繁琐、检测敏感程度低、检测操作水平要求高和检测时间过长等缺点[9]。表型鉴定法能够达到细胞组分、蛋白质、生理生化和形态这3个层面的鉴定，目前MALDI-TOF和全自动生化鉴定都被临床大量应用。MALDI-TOF是一种软电离质谱技术，该技术采用软件和参考数据库相结合的方法对病原微生物进行检测[10]。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测技术一般依靠细菌的参考图谱对细菌的种类进行鉴定，但是存在少部分遗传背景相似的菌株较难判断的情况。全自动病原微生物生化鉴定系统需要将细菌过夜培养形成菌落才能够满足检测分析的基本条件，且数据库中的病原菌种类有限进而导致了该系统应用上的局限性[11]。全自动药敏分析也是基于表型的病原菌诊断方法，与手工药敏相比缩短了检测时间并提高了检测通量，但病原菌培养和增殖步骤的检测流程仍然缓慢。因此，研发新的病原微生物快速检测和鉴定技术具有重要意义。

2 拉曼光谱技术原理

为了对微生物进行更加深入的探究，国内外科学家研究了许多光谱技术，其中最具代表的为拉曼光谱检测技术[12]。拉曼光谱的概念由印度物理学家Raman在1928年首次提出，随着激光技术的迅速发展，拉曼光谱技术也随之得到了广泛应用。当光照射到物质表面时会发生散射现象，有部分光波频率发生了变化产生非弹性散射，这种非弹性散射光被称为拉曼光谱。在散射过程中，入射光与物质相互作用，物质内部分子与光子发生了能量交换，改变了出射光的能量，即光子的频率发生了改变，此频率变化的差值称为拉曼位移[13]。拉曼位移仅取决于散射分子的内部结构，可为分子定性分析提供依据[14]。生物大分子(如糖类、蛋白质、脂类、核酸等)中不同化学键及官能团的振动频率，对应着不同的拉曼位移，这就意味着拉曼光谱可以提供待测样品分子成分和结构的指纹图谱，可用于分析检测生物组织生化成分以及探索生物分子结构。

拉曼光谱通过提供待测样品中各成分分子的振动光谱信息，对样品成分进行精确分析，以此鉴别不同的细胞组织。近年来，围绕拉曼光谱技术衍生发展出许多亚技术，如表面增强拉曼光谱(SERS)、傅里叶变换拉曼光谱(FT-Raman)、激光共振拉曼光谱(RRS)、共聚焦显微拉曼光谱等相关技术。傅里叶变换拉曼光谱技术[15](FT-Raman)是在传统技术的基础上，对收集到的拉曼信号进行了傅里叶变换处理，此技术对样品本身荧光干扰进行了改善，并且具有检测速度快、灵敏度高的优势。表面增强拉曼光谱技术[16](SERS)主要针对于拉曼信号较弱的不足进行了改进，将待测物分子吸附在金、银等贵重金属胶粒或粗糙的纳米金属表面，使待测物的拉曼信号增强了106～1015倍，大大提高了检测灵敏度。激光共振拉曼光谱技术(RRS)是当激发光波长与待测物分子电子跃迁波长相同时发生的，该分子的某几个特征带的拉曼信号强度比常规散射要高出约106倍，灵敏度得到了极大的提升，更加适用于生物大分子的检测[17]。共聚焦显微拉曼光谱技术[18](CRM)是将共焦光学显微技术与拉曼光谱检测技术结合起来的一种新技术，利用光学显微物镜将激光光束聚焦至待测样品表面上一点，从而减小了外部环境对检测结果的干扰，还可以通过调节激光聚焦深度的检测模式，分析不同深度的物质结构信息。这些技术凭借着其无破坏性、非接触性、稳定且可实时监测的特点在生物医学领域发展迅速。作为一种多功能的生物医学分析工具，拉曼光谱技术在细胞的动态观察、疾病的诊断及检测、病原微生物的鉴定及药物敏感性检测等方面具有极大潜力。拉曼光谱技术能够对少量微生物样本进行快速、准确、无损的检测，在病原微生物检测、疾病诊断等领域得到了迅速发展。全细胞拉曼光谱指纹图谱包括了细胞内所有的生物信息，包括蛋白质、脂类以及糖类等，可以通过对这些生物大分子的含量与结构进行测定分析，确定微生物种类、生理特征以及突变表型，最终完成对病原微生物的鉴定[19]。

3 拉曼光谱应用于病原微生物检测的研究进展

拉曼光谱技术作为一种对物质结构、化学组成以及生长代谢过程进行分析检测的手段，被广泛应用于微生物学的研究领域中。随着以拉曼光谱检测技术为核心的亚技术诞生，改善了以往拉曼光谱技术信号强度弱的不足，实现了对微生物高精度的快速检测分析。

3.1 病原微生物的分类与鉴定

近年来，在细菌分类和鉴定的临床医学相关领域涌现了许多以细菌培养为基础的快速检测技术，如质谱法、荧光法、PCR技术等，但这些方法均存在操作繁琐、成本高、耗时长等问题。拉曼光谱蕴含着细胞中丰富的生化信息，如核酸、糖类、蛋白质等，可作为“生化指纹”解释细胞内分子结构组成、代谢活性以及生理状态。大量的研究表明拉曼光谱技术可直接对细菌感染的临床样品进行非接触快速检测，这也使其成为了病原微生物无损分析检测领域的焦点。

陈雪萍[20]构建了无标记的基于AgNPs+的表面增强拉曼光谱技术(SERS)检测方法，结合多变量统计分析对金黄色葡萄球菌进行种属鉴定。并对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌与甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌的差异特征进行分析。得出结论：基于AgNPs+的SERS检测方法可探测到单个细菌的信号；耐药菌株与敏感菌株的拉曼光谱谱峰的位置、强度和相对强度比例均有差异。陶站华[21]等利用光镊拉曼光谱技术研究吲哚对金黄色葡萄球菌细胞中葡萄球菌黄素合成的抑制作用。结果表明：光镊拉曼光谱技术可作为分析葡萄球菌黄素含量的有效方法。针对耐药白色念球菌的鉴别与对不同机理抗菌药的快速分类研究，李皓[22]对SERS进行了改进，提出了动态表面增强拉曼光谱法(D-SERS)，即当纳米溶胶与待测分子溶液混合时就开始进行光谱采集，完成湿态到干态的动态采集过程，实验结果表明此检测方法准确度较高，对临床用药具有很大意义。董金颖[23]在实验中选用10株标准纯菌株，利用共聚焦显微拉曼光谱技术对其进行检测分析，得出结论：拉曼光谱可以应用于同种病原菌水平上的鉴定。此外，还利用共聚焦显微拉曼光谱技术对等比例混合培养的鲍曼不动杆菌与大肠埃希菌进行了检测分析，发现混合培养物与纯标准菌株的拉曼光谱存在细微差别。邵琳[24]等对肠炎沙门氏菌的高效检测方法进行研究，将其分别与三条适配体结合，选用表面增强拉曼光谱技术进行信号采集，结果可以看出光谱在735 cm-1处有峰形尖锐的明显特征峰，此处特征峰归属为胞嘧啶与尿嘧啶的代谢产物。对5种细菌混合培养后进行拉曼光谱检测，通过特征峰强度的对比能够在混合样品中准确检测出目标细菌肠炎沙门氏菌。得出结论：这种检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好，可用于肠炎沙门氏菌的高效检测。单细胞拉曼光谱技术还可用于鉴定血液透析用水中的病原微生物，Montanari[25]等选用288份血液透析用水中分类出的146株酵母菌，采用单细胞拉曼技术结合经典微生物检测技术的方法对其进行鉴定分析，并与标准菌株的拉曼光谱进行了比较，成功鉴定出了待测样本中的菌株。苏永波[26]等使用便携式拉曼仪器对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及变形杆菌分别进行了信号采集，得出结论：三种细菌特征峰位置及强度均有明显差异，因此SERS可用于此三类细菌的鉴别。有研究表明，表面增强拉曼光谱技术可为鉴别大肠杆菌与志贺氏菌病原体研究与应用提供依据。吕璞等[27]曾选择大肠杆菌与志贺氏菌作为研究样本，对其进行检测，在600～700 cm-1拉曼图谱范围内两种菌的光谱图可见明显差异，且重现性良好。Stockel[28]等人对26种不同的分枝杆菌进行检测分类，每种待测样本菌选用50～100个完整的细胞进行研究，通过单细胞拉曼技术检测并根据拉曼信号特征峰差异进行分析，成功区分了26种样本，且准确率高达94%。可见拉曼光谱技术可为鉴定密切相关菌提供有效的鉴定方法。宋一之等[29]将单细胞拉曼光谱与机器学习模型结合，实现了免培养和免染色的细菌革兰氏染色分类鉴定预测，准确率甚至可高达100%，并且可以在尿液和血液感染样品中成功应用。

3.2 病原微生物药物敏感性研究

病原菌药敏试验是对病原菌进行抗生素敏感度检测，根据其对不同抗生素的药敏检测结果，有选择性地指导患者用药。目前，临床诊断药敏试验需要检测病原微生物抗生素最小抑制浓度，此过程往往需要2～5 d的时间进行培养及分析。拉曼光谱技术具有超强的分辨能力，可以快速、非破坏性的对病原菌代谢活性进行检测。相较于传统方法，该技术无需制备样品、无需进行微生物培养的优势，使其成为了最适用于微生物耐药性检测的重要方法。

Berry[30]等发现，具有代谢活性的细菌可以被重水标记，其单细胞拉曼光谱中出现碳-氘化学键的特征峰(C-D峰)，因此首次提出了重水标记结合拉曼光谱技术可以实现对细菌代谢活性的检测。2017年，宋一之等[31]提出：耐药菌的识别可以通过检测重水和抗生素同时作用后细菌单细胞拉曼的C-D峰实现，这一方法不需要对细菌进行分离纯化和增殖，因此可用于耐药菌的原位识别。Tao等[32-33]采用该方法，对导致龋齿的口腔微生物样本在抗菌药物作用后进行耐药性检测，能够无损且定量的对口腔药物的药效进行评价，并提出了细菌代谢活性最小活性抑制剂浓度这一药敏评价的指标，但也发现氨苄西林等抗生素尽管抑制细菌生长，但不抑制细菌单细胞代谢活性。Yang[34-35]等将该技术用于评价尿液病原菌的药敏，发现仅需检测40倍最小抑菌浓度抗生素作用后细菌单细胞的C-D峰强度特征，就可以快速判断病原菌对该抗生素的敏感性。Hong[36]等将氘标记与受激拉曼光谱技术结合，检测与万古霉素混合培养的肠球菌对含氘葡萄糖进研摄取后细胞内的C-D键拉曼强度，判断细胞代谢活性。宋一之团队[29]发现将抗生素与重水在不同时间点加入菌液或标本，可以减小氨苄西林等抗生素对细菌生长和代谢活性抑制效果的差异，提高了该技术在药敏检测中的准确率，建立了快速拉曼药敏(FSAST)检测方法。通过采集3 000多个实验组的拉曼光谱，该团队证明FRAST方法可直接用于真实尿液和血液标本，其药敏结果与金标准总体一致率大于88%，尿液和血液药敏检测的时间可以分别缩短至3和21 h。上述研究证明了重水标记拉曼光谱术具有普遍适用性，可推广至所有微生物细胞及对细胞代谢水平产生影响的药物的检测。

非同位素标记拉曼光谱技术也被应用于微生物药敏检测。付世杰[37]通过体外拉曼光谱检测与体内成像动物检测模型实现了细菌对抗生素敏感性的快速评价，研究采用表面增强拉曼光谱技术快速评价了不同浓度种类的抗生素对细菌活性的影响。此外，还发现了抗生素在低浓度的条件下不能抑制细菌生长，反而会导致细菌增多的现象，这对临床药物评价具有指导意义。Germond[38]等通过实验筛选出11株对不同抗生素产生抗体的大肠杆菌作为研究对象，采用非标记的方法对其进行检测，预测了大肠杆菌获得性耐药的拉曼光谱标识，通过实验发现，耐药基因的表达与拉曼特征峰强度具有明显相关性(p<0.05)。Kelly[39]等发现细菌发酵代谢产生的气体在金银纳米粒子表面会解离为甲基硫，吸附在表面形成的金硫键或者是银硫键都可以产生极强的拉曼信号。采用表面增强拉曼光谱技术检测气体产生量，可以间接的检测出细菌活性。苏蓝[40]对两种常见致病菌进行了光谱检测与分析。采用SERS技术检测发现，可以根据特征峰的位置与强度对其进行区分。此外，还将SERS技术应用于对致病菌以及其耐药菌株的快速鉴别，为临床病原菌快速检测以及个体化用药提供了理论依据。对于拉曼检测技术的可靠性验证，刘晓莹[7]在其研究中利用抗生素诱导筛选了金黄色葡萄球菌的耐药菌株，并且结合最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)、药敏纸片、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)、SERS技术以及激光共聚焦显微拉曼技术对细菌进行了耐药性鉴定以及方法学验证。得出结论：SERS技术在检测抗生素敏感菌与致病菌方面具有很高的有效性和可靠性，为SERS技术在临床病原微生物耐药性检测领域的应用奠定了基础。

以上研究均可表明：拉曼光谱技术作为一种快速、准确和灵敏的微生物表型表征方法，在病原微生物快速鉴定以及药敏检测领域具有广阔的发展前景。近年来，随着光谱技术的迅速发展，对拉曼检测技术的研究逐渐步入成熟期，但将其广泛应用于临床检测，仍存在一定的改进空间，随着光谱技术的发展和更精确灵敏光学元件的开发，病原微生物的快速精准检测也将指日可待。

4 总结与展望

拉曼光谱技术在生物领域得到广泛应用，尤其是在病原微生物检测方面优点突出。拉曼光谱技术可直接对细菌感染的临床样品进行非接触快速检测。相较于传统方法，拉曼光谱技术具有无需制备样品、无需进行微生物培养的优势，使其成为了适用于微生物耐药性检测的重要方法。拉曼光谱检测方法将临床标准药敏所需的48 h缩短至2.5 h内完成，为临床快速诊断与精准用药提供了依据。拉曼光谱检测成功克服传统检测的缺点，所需的样品量少、标本鉴定预处理简单、检测能力强、检测时间短、检测特异性强、对于被测物无损伤、分离和鉴定可以同时进行。首先，大量生物学信息的处理需要更加智能化的分析系统和数据库。目前大量光谱数据分析和数据模型的建立仍需依赖专业的生物信息团队。近年来不同的光谱分析软件和数据库的纷纷涌现，这代表着智能化、便捷的分析方法已经成为研发人员关心的问题，随着研究成果的逐渐成熟将极大推动该方法的临床应用。其次，单细胞拉曼技术各项操作的标准化有待进一步建立。目前拉曼光谱检测方法不统一，不同类型样本背景信号对不同检测方法的干扰存在差异，导致样本的前期处理、参数设置等存在一定差异，这些差异极大地限制了在拉曼光谱技术临床应用中的标准化。同种拉曼检测方法的操作标准化、不同种检测方法的结果差异比对将是拉曼光谱技术广泛应用于临床的最大问题。综上所述虽然拉曼光谱技术存在一些问题但它在临床病原微生物检测上具有非培养、高保护性、高特异性、快速性、高效性、低成本和高效分离细胞建立微生物表型的优势，使其在临床微生物检测领域具有极大的发展潜能，值得深入研究。