柠檬桉油自微乳递送系统的制备及其药剂学性能*

兰斯琦， 刘欢欢， 支苑， 张丽丹， 唐永瑜， 汪巳卜， 张敏，沈祥春*， 陶玲*

(1.贵州医科大学 药学院， 贵州 贵阳 550025； 2.贵州省特色天然药物资源高效利用工程中心， 贵州省高等学校天然药物药理与成药性评价特色重点实验室， 贵州医科大学-贵阳市联合重点实验室， 天然药物资源优效利用重点实验室， 贵州 贵阳 550025； 3.贵州医科大学 基础医学院， 贵州 贵阳 550025)

柠檬桉油又称桉叶油、白千层脑及桉树脑，是从桉树叶、玉树、樟树及月桂等植物的油腺细胞中分泌的芳香精油，无色或微黄色油状[1]。柠檬桉油呈特有清凉桉叶香气和樟脑气味，有辣口清凉感，香气强烈而不持久，具有疏风、清热解毒、祛风止痒等多种作用[2]；现代药理研究表明，柠檬桉油还具有抗菌、抗炎、抗氧化、杀虫驱蚊及透皮促吸收等作用[3-7]，有一定防霉和杀菌防腐作用，被广泛地应用于农业、工业、医药及香料等日常生活品及医药用品方面[8-11]，也是目前常用医药用制剂。柠檬桉油几乎不溶于水，易溶于无水乙醇、油和脂肪中，传统溶液剂等不利于发挥其效应[12-14]。自微乳递送系统(self-microemulsifying drug delivery system，SMEDDS)作为新型药物递送系统，由乳化剂、助乳化剂、油相及目标药物共同组成的预浓缩微乳，临用前用水稀释，或在给药部位遇体液后自发形成微乳，可改善药物溶解度、降低表面张力、增强膜穿透性及提高生物利用度[15-17]；自微乳还具有热力学稳定性的优势，在增强药物的稳定性方面起着重要作用，可避免贮藏中分层等问题[18-20]；同时自微乳还能增进药物对角质层屏障的透过，增强药物的渗透性[21-24]；另外，自微乳还具有良好的缓释作用，能够更好地发挥其药效[25-26]。自微乳递送系统使用便利、容易制备、便于生产等亮点，近年来该剂型的研究倍受关注[27-29]。本研究基于SMEDDS的基础，应用星点设计-效应面法建立伪三元相图，筛选油相、乳化剂和共乳化剂的种类和比例，对柠檬桉叶油SMEDDS的处方进行优化，并进行药剂学性能表征，为其更好的临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1药剂与主要试剂 柠檬桉油和聚氧乙烯蓖麻油(上海阿拉丁)，吐温-80和无水乙醇(国药集团)，磷钨酸(天津大茂)，15-羟基硬脂酸聚乙二醇酯(徳国巴斯夫)，1,2-丙二醇(天津瑞金特)，甘油(山东瑞生)。

1.1.2主要仪器 Nanobrook 90Plus PALS电位和纳米粒度分析仪(美国布鲁克海文)，BS-223S型分析天平(北京赛多利斯)，ME104/02型分析电子天平(上海梅特勒-托利多)，XH-C型旋涡混合器(金坛白塔新宝)。

1.2 研究方法

1.2.1溶剂伪三元相图的构建 混合乳化剂采用乳化剂与助乳化剂以一定的质量比(Km)混匀。按照1 ∶9、2 ∶8、3 ∶7、4 ∶6、5 ∶5、6 ∶4、7 ∶3、8 ∶2及9 ∶1(W/W)的质量比混合(固定体系质量为1 g)油相与混合乳化剂，涡旋状态下持续加入超纯水，记录液体体系中由浑浊至澄清时加水量及各组分的质量百分数。分别以水相、油相、Km作为3个顶点，利用Orgin 7.5软件构建伪三元相图，以乳化区域面积(图中M区域)作为考察指标。

1.2.2乳化剂的种类的考察 固定油相为柠檬桉油，助乳化剂为无水乙醇，Km为2 ∶1，总质量为1 g。设置油相 ∶混合乳化剂为1 ∶9、2 ∶8、3 ∶7、4 ∶6、5 ∶5、6 ∶4、7 ∶3、8 ∶2及9 ∶1，分别采用吐温80、聚氧乙烯蓖麻油及HS15进行乳化剂种类的考察。精密称量各比例油相与混合乳化剂置于试管中，涡旋，25 ℃超纯水滴定，至溶液浑浊且再滴加无变化；肉眼直接观察，将形成具有蓝色乳光的澄明溶液点确定为自微乳的可形成区域，以此作为相变点为临界点的加水量绘制伪三元相图。

1.2.3助乳化剂的选择 根据上述结果，确定HS15为乳化剂，固定油相为柠檬桉油，固定总质量为1 g，分别设置甘油、无水乙醇、丙二醇为助乳化剂。将乳化剂和助乳化剂按Km为2 ∶1混匀，再与油相按9 ∶1、8 ∶2、7 ∶3、6 ∶4、5 ∶5、4 ∶6、3 ∶7、2 ∶8及1 ∶9的比例混匀、涡旋，25 ℃超纯水滴定；肉眼观察，自微乳的形成区域以澄明溶液并具有蓝色乳光的点确定，加水量为混匀体系由浑浊到澄清时的量，以各组分在浑浊到澄清时临界点的质量百分数绘制伪三元相图；自微乳化区域采用相图中自微乳区边线以水的顶点作切线，朝向混合乳化区顶点区域内的体系可用水无限稀释，根据相图中自微乳区域筛选助表面活性剂；伪三元相图面积结果提升甘油和丙二醇的乳化面积较大，但由于常温下易分层不稳定，故选用无水乙醇作为助乳化剂。

1.2.4Km的确定 根据伪三元相图面积，油相采用柠檬桉油，乳化剂为HS15、无水乙醇为助乳化剂，考察不同Km(1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1及3 ∶1)对微乳形成的影响。

1.2.5油与Km比例的考察 以柠檬桉油为油相，HS15为乳化剂、无水乙醇为助乳化剂，根据伪三元相图面积，考察不同油相与Km之间比例(9 ∶1、8 ∶2、7 ∶3、6 ∶4、5 ∶5、4 ∶6、3 ∶7、2 ∶8及1 ∶9)对微乳形成的影响，确定初步的柠檬桉油自微乳处方。

1.2.6星点设计-响应面法优化处方 为了更好地评价柠檬桉油自微乳的处方，根据伪三元相图筛的结果，以粒径为评价指标，油相质量百分比(X1)和Km(X2)作为影响自微乳性质的考察因素；“1.2.3”项下实验考察结果证实，油相质量分数为20%～70%成乳效果好，有利于自微乳体系的稳定与形成，因此本研究设定油相质量分数为20%～70%，Km值采用伪三元相图考察；最大的乳化面积时Km为2，故Km的范围为1～3；采取星点设计-效应面优化法，以粒径(Y)为评价指标优化处方，各成分进行多元线性回归和二项式的拟合使用Design expert 8.0.6软件，拟合方程绘制表达各指标与各成分之间关系的三维效应面，响应面优化由曲线图确定。油相与Km值的水平见表1。

表1 柠檬桉油自微乳处方因素与水平Tab.1 Prescription factors and levels of lemon eucalyptus oil from microemulsion

1.2.7柠檬桉油SMEDDS药剂学性能考察 取按照最佳处方制备所得的柠檬桉油SMEDDS，超纯水稀释10倍，观察其外观；采用Nanobrook 90Plus PALS电位及纳米粒度分析仪，测定稀释后的柠檬桉油SMEDDS粒径大小、分布情况以及Zeta电位。

2 结果

2.1 乳化剂种类

伪三元相图面积表明， HS15、聚氧乙烯蓖麻油和吐温80的乳化面积中HS15乳化面积最大，且相对稳定、不易分层。见图1。

图1 不同乳化剂制备的柠檬桉油伪三元相图面积Fig.1 Pseudo-ternary phase diagram area of lemon eucalyptus oil prepared with different emulsifiers

2.2 助乳化剂

伪三元相图的乳化面积结果表明，柠檬桉油为油相，HS15为乳化剂，无水乙醇、丙二醇及甘油作为助乳化剂的相图面积从大到小依次为甘油、丙二醇及无水乙醇，但丙二醇和甘油作助乳化剂时，其稳定性较差，易于分层，故选无水乙醇作为助乳化剂。见图2。

图2 不同助乳化剂制备的柠檬桉油伪三元相图面积Fig.2 Pseudo-ternary phase diagram area of eucalyptus lemon oil prepared by different auxiliary emulsifiers

2.3 Km值

在上述研究结果的基础上，固定总质量为1 g，以柠檬桉油为油相，HS15为乳化剂，无水乙醇为助乳化剂，分别设置Km值为1 ∶1、1 ∶2、2 ∶1及3 ∶1，油相与Km值的比例分别为9 ∶1、8 ∶2、7 ∶3、6 ∶4、5 ∶5、4 ∶6、3 ∶7、2 ∶8及1 ∶9，进行伪三元相图的绘制，结果表明Km值为1 ∶1、1 ∶2、2 ∶1及3 ∶1的伪三元相图中Km为3 ∶1时其微乳区域面积最大，但因静置易分层，故选择Km值为2 ∶1进行下一步研究。见图3。

图3 不同Km值制备的柠檬桉油伪三元相图面积Fig.3 Pseudo-ternary phase diagram area of lemon eucalyptus oil prepared with different Km values

2.4 油与Km比例

结果表明，柠檬桉油与乳化剂Km比例为1 ∶9时没有乳化现象，比例为8 ∶2和9 ∶1时不稳定、容易分层，比例为2 ∶8、3 ∶7及4 ∶6时外观呈半透明且带有蓝色乳光的均一乳液且较为稳定、不易分层。因此，初步确定油相与Km之间的比例为2 ∶8、3 ∶7及4 ∶6来进行下一步考察。见表2。

表2 柠檬桉油与乳化剂Km比例的考察Tab.2 The investigation of lemon eucalyptus oil to Km ratio

2.5 星点响应面优化处方

表3 处方的星点设计与结果Tab.3 Prescription dot design with results

2.6 效应面分析

当油相的质量分数一定时，粒径随着Km值的增大而减小；当Km值一定时，随着油相质量分数增加，粒径相应减小，呈反比的关系；与油相相比，Km对粒径的影响较大，通过三维效应面图、拟合方程及软件预测等综合分析，确定以粒径大小为考察指标，理论最佳处方中油相占比为45%，Km为2 ∶1，即柠檬桉油45%、HS15 36.7%及无水乙醇18.3%。见图4。

注：颜色越深表示变化趋势越急剧。图4 柠檬桉油粒径的三维效应面分析Fig.4 Three-dimensional effect surface analysis of the grain size of lemon eucalyptus oil

2.7 处方验证

按照优化的最佳处方，精密称取HS15 0.366 7 g、无水乙醇0.183 3 g，及柠檬桉油0.450 0 g，涡旋混匀，旋涡过程中逐滴加纯水8 mL，制备得柠檬桉油自微乳液，呈略带蓝色乳光的半透明微乳；粒径测定结果提示，最佳处方粒径的真实值与预测值未见明显差异，指标的相对误差均小，提示星点设计-效应面法所拟合的方程在本研究中预测效果良好。见表4。

表4 柠檬桉油自微乳液粒径的真实值与预测值Tab.4 Real and predicted particle size of lemon eucalyptus oil self-microemulsion

2.8 最佳处方的确定

结合前述结果，选用得到的最佳处方为油相为柠檬桉油，表面活性剂为HS15，助表面活性剂为无水无水乙醇，Km=2 ∶1。

2.9 柠檬桉油自微乳性质考察

制备所得的柠檬桉油自微乳为蓝色乳光的均一液体，有良好的流动性，静置不分层；稀释后的柠檬桉油SMEDDS粒径测定结果表明，其平均粒径为49.05 nm，粒度分布呈单峰态势，Zeta电位为5.33 mV。见图5。

图5 柠檬桉油自微乳的性质考察Fig.5 Study on the properties of lemon eucalyptus oil self-emulsion

3 讨论

HS15是新型非离子型增溶剂和乳化剂，安全范围大，已被德国、英国、美国及欧洲药典收录[30]。本课题组前期制备的相关剂型考察结果表明，其具有良好的乳化性、稳定性和均一性[31]。本研究结果表明，该剂型在柠檬桉油SMEDDS的制备过程中也发挥了重要作用。

柠檬桉油为具有较强的挥发性化合物构成的挥发油体系，当前采用的开放式系统的溶出度考察方法容易导致挥发性物质的丢失，从而难以完全代表柠檬桉油的特性[32-33]，因此本研究没有进行柠檬桉油溶出度的考察。

油相、乳化剂、助乳化剂的种类及比例能够明显影响微乳的理化性质[34]。本研究采用柠檬桉油作油相，HS15与甘油Km值为2 ∶1做混合乳化系统的处方乳化面积最大，但因分层不稳定而采用其他方案。因此采用正交设计和均匀设计的方法容易导致SMEDDS的考察精度不够，数学模型预测性难以获得理想的结果[35]，故本研究采用自微乳体系广泛使用的星点设计-效应面法，优化设计混合乳化剂与油相的配比，结果证实该方法能够获得更合理和更准确的结果。

通过观察与选择，本研究确定了柠檬桉油SMEDDS的处方。根据乳化面积等比较可得到油相 ∶乳化剂为45% ∶55%效果较佳，具体工艺为称取处方量的柠檬桉油、HS15、无水乙醇置于试管中，磁力搅拌混合均匀，得油相；涡旋状态下，向油相中缓慢滴加处方量的纯化水，即得柠檬桉油自微乳。

本研究单因素考察采用利用伪三元相图，星点设计-效应面法优化柠檬桉油SMEDDS处方，分析其药剂学性能表征，为柠檬桉油资源的优效配置与使用提供新型药物递送系统的参考。