吡虫啉对豌豆蚜GSTs和MFO酶活力的影响

郭耀霞，张廷伟，刘长仲，张育霞

（甘肃农业大学植物保护学院，甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，兰州 730070）

豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）属半翅目蚜科，是在全世界范围内危害多种豆科作物和牧草的寡食性害虫，也是我国西北地区苜蓿田中的优势害虫[1-2]。该虫在其年生活史当中孤雌生殖，繁殖速度快，种群数量大，除直接取食为害外，还能传播苜蓿花叶病毒、豌豆耳突花叶病毒等25种病毒[3-4]，为农牧业害虫主要防治对象[5-6]。长期以来，豌豆蚜的防治主要依赖化学杀虫剂[7]，其中吡虫啉作为一种取代有机磷及拟除虫菊酯类的新烟碱类杀虫剂，具有胃毒、触杀、内吸等作用[8-9]，以广谱、高效、安全、低毒等特点被广泛应用于刺吸式口器害虫的防治[10]。由于吡虫啉作为防治蚜虫等害虫的高效首选药剂被大量使用[11]，豌豆蚜对吡虫啉等新烟碱类杀虫剂的解毒代谢问题已成为豆科植物害虫防治中的首要任务。对于昆虫的解毒代谢问题，国内外学者做了大量的研究，如Matsuura等[12]研究发现日本棉蚜（Aphis gossypii）对不同新烟碱类杀虫剂解毒代谢能力不同；杨焕青等[13]研究发现棉蚜对吡虫啉产生抗性的主要原因是解毒酶比活力提高；邱高辉等[14]研究了麦长管蚜（Sitobion avenae）对吡虫啉的抗性发展中多功能氧化酶（MFO）和羧酸酯酶（CarEs）起重要作用；帅霞等[15]等研究表明桃蚜（Myzus persicae）抗性品系解毒酶活性高于敏感品系；汝阳等[16]研究报道二斑叶螨（Tetranychus urticae）对阿维菌素的代谢过程，其体内谷胱甘肽-S-转移酶（GSTs）和MFO起主要作用。当前有关吡虫啉对豌豆蚜体内GSTs和MFO 2种解毒酶活力变化规律的研究报道较少，鉴于豌豆蚜在西北地区豆科植物上为害的严重性，尤其是对苜蓿产业的严重威胁，本研究在测定吡虫啉对豌豆蚜的致死中浓度（LC50）的基础上，测定了吡虫啉对豌豆蚜GSTs和MFO 2种解毒酶活力的影响，进一步探索豌豆蚜对吡虫啉的抗性机理，为豌豆蚜的抗药性治理和新烟碱类杀虫剂的合理使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试材料

供试害虫为豌豆蚜，其敏感品系种群来自甘肃农业大学苜蓿试验田，期间未接触过化学农药。豌豆蚜抗性品系是由敏感品系在室内经对吡虫啉进行喷雾死亡率达70%筛选而获得。抗性选育时，每2周筛选1次，每2代进行一次毒力测定，连续选育6代。

1.1.2 供试药剂

98.5%吡虫啉原药，青岛海利尔药业有限公司；考马斯亮蓝G-250，上海谱振生物科技有限公司；牛血清蛋白，上海源聚生物科技有限公司；对硝基苯甲醚，上海康拓化工有限公司。

1.1.3 供试仪器

酶标仪，美国伯腾仪器有限公司。

1.2 室内毒力测定

室内毒力测定采用带虫浸叶法[15]。将吡虫啉原药用丙酮溶解后稀释成6个浓度梯度，将带有豌豆蚜的蚕豆叶片用纱布包裹叶柄后浸在不同浓度药液中5 s，反面朝上放置在培养皿中，置于温度24℃、光照16 h∶8 h（L∶D）的光照培养箱中饲养。48 h后用毛笔轻轻触动虫体检查存活情况，以虫体附肢完全不动者记为死亡，统计死亡率。每个浓度处理30头，重复3次，以蒸馏水处理作为空白对照。利用SPSS 19.0软件中的Probit模块中概率单位回归法求出LC50，抗性倍数（RR）按式（1）计算。

1.3 酶源蛋白含量测定

酶源蛋白含量测定参照Bradford[17]的考马斯亮蓝G-250染色法进行。在酶标板孔中加入200μL 0.002 5%考马斯亮兰G-250和50μL酶液，置于25℃下10 min，在595 nm处测OD值，根据牛血清蛋白标准曲线求出蛋白质含量。

1.4 酶活力测定

1.4.1 酶液制备

取10头无翅成蚜，于冰浴中加入1.5 mL 0.1 mol/L、pH 7.6的磷酸缓冲液（PBS）［含1 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）、1 mmol/L二硫苏糖醇（DTT）、1 mmol/L苯基硫脲（PTU）、1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）及20%甘油］进行匀浆，4℃下10 000 r/min离心20 min，取上清液作为粗酶液，冰浴备用。

1.4.2 GSTs活性测定

GSTs测定参照Habig等[18]的测定方法：分别将1.2 mmol/L CDNB、6 mmol/L GSH、酶液、0.1 mol/L pH 7.6 PBS各100、100、10、90μL加到酶标板孔中，在340 nm处，以1 min为间隔，记录15 min内OD值的变化，每处理设置6个重复。按式（2）、（3）计算GSTs活性。

式中：ΔOD340为每分钟变化值；V为反应总体积，μL；ε为消光系数，9.6 mL/(μmol·cm)；L为光程，1 cm；比活力，μmol/[min·mg(pro)]。

1.4.3 MFO活性测定

MFO活性测定参照Rose等[19]的测定方法，用无水乙醇配成的母液溶解对硝基苯甲醚，再用缓冲液稀释成2 mmol/L。将稀释后的缓冲液取100μL加到酶标板中，再加入80μL酶液，于27℃温育3 min后加入10μL NADPH开始反应。在405 nm处，以1 min为间隔，记录10 min内OD值的变化。MFO活力以每分钟每毫克组织蛋白催化产生的对硝基苯酚的含量表示。MFO比活力参照式（3）计算。

2 结果与分析

2.1 豌豆蚜抗吡虫啉品系的选育

由表1可以看出，红绿色型豌豆蚜对吡虫啉抗性发展较为缓慢，但随着选育代数的增加，抗性倍数逐渐增加。经连续6代药剂筛选后，红色型（RMP）、绿色型（GMP）豌豆蚜对吡虫啉的敏感度（LC50）分别由选育前的0.149 2、0.136 3 mg/L提高为选育后的0.499 0、0.429 9 mg/L；抗性分别增长到3.34和3.15倍。2种色型相比，红色型较绿色型抗性倍数增长更快。在抗性筛选过程中，毒力回归方程的斜率有变小的趋势，说明豌豆蚜群体中抗性个体不稳定，群体发生了异质性变化，抗性倍数有进一步增加的潜力。

表1 豌豆蚜吡虫啉抗性选育结果

2.2 吡虫啉对2种色型豌豆蚜GSTs比活力的影响

用吡虫啉处理后豌豆蚜体内GSTs比活力变化见表2。2种色型豌豆蚜体内GSTs比活力随着选育世代的增加均有显著升高。F0～F8各世代间解毒酶活性变化有显著差异。GMP F8GSTs比活力达到26.68μmol/[min·mg(pro)]，较F0比活力增加15.10 μmol/[min·mg(pro)]，是F0比活力的2.3倍。RMP F8GSTs比活力达到28.35μmol/[min·mg(pro)]，较F0代比活力增加18.51μmol/[min·mg(pro)]，是F0比活力的2.88倍。通过吡虫啉处理后，2种色型豌豆蚜体内的GSTs比活力均有所增加，表明豌豆蚜对吡虫啉产生抗性可能与GSTs比活力增强有关。

表2 豌豆蚜吡虫啉抗性选育过程中GSTs活性变化

2.3 吡虫啉对2种色型豌豆蚜MFO比活力的影响

经吡虫啉连续筛选后豌豆蚜MFO活性变化见表3。随着筛选代数的增加，2种色型豌豆蚜F0～F8体内的MFO比活力均有所提高，且有显著差异。GMP豌豆蚜F8MFO比活力为1.72μmol/[min·mg(pro)]，与F0相比较比活力增加0.53μmol/[min·mg(pro)]，是F0比活力的1.45倍；RMP F8MFO比活力达到2.05 μmol/[min·mg(pro)]，是F0比活力的1.56倍，表明豌豆蚜对吡虫啉产生抗性可能与MFO比活力增强有关。

表3 豌豆蚜吡虫啉抗性选育过程中MFO活性变化

3 结论与讨论

本研究结果表明，随着选育代数的增加，红绿色型豌豆蚜体内的GSTs和MFO比活力和活性比均有所提高，且F2～F8代豌豆蚜的GSTs、MFO活性较F0差异显著。此外，在豌豆蚜对吡虫啉解毒代谢过程中，红色型解毒酶比活力的升高较绿色型更显著。然而，本试验仅测定了吡虫啉对豌豆蚜体内GSTs和MFO酶活性变化的影响，为深入了解吡虫啉对豌豆蚜体内解毒酶的活性影响，今后还需进一步研究其体内其他解毒酶的活性变化，为深层次揭示豌豆蚜对吡虫啉解毒代谢发展规律提供科学佐证。