基于水凝胶3D生物打印在组织工程中的应用

王超威，张铭，闫立论，夏培斌，刘念念，李丹杰，刘志远，程杰，崔景强

(河南省医用高分子材料技术与应用重点实验室 河南驼人医疗器械集团有限公司，河南 长垣 453000)

3D打印又称增材制造技术，是一种以计算机为辅助设计工具，通过对模型切片处理，以逐层叠加的方式快速呈现目标的技术，3D打印以其个性化定制、快速成型的优势在航空航天、汽车零部件、生物医学、教育教学等方面起到了重要的作用。3D生物打印作为3D打印的一个分支，从广义上来说，是直接为生物医疗行业服务的3D打印，而从狭义上来说，3D生物打印是以装载细胞的生物墨水为打印材料进行具有生物学活性的组织器官支架，芯片等的3D打印技术。当前结合细胞进行3D生物打印逐步成为研究的热点，在组织工程再生、药物筛选、疾病治疗等方面具有良好的预期应用及前景[1]。

在3D生物打印中，水凝胶以其良好的生物相容性及高的含水率，可以模拟细胞外基质（ECM）及调节细胞命运的特点，在组织工程中得到了广泛的应用，作为一种高度水合的三维聚合物，水凝胶可以促进三维环境下的基质重塑、细胞迁移和细胞黏附，满足了功能组织正常发育所必需的条件，本文将从水凝胶3D生物打印技术、3D生物打印水凝胶、水凝胶3D生物打印在组织工程中应用及其发展趋势方面进行阐述。

1 水凝胶3D生物打印技术

水凝胶材料因含有大量的水分，其打印需要温和的条件，应用于水凝胶3D生物打印的技术主要有三种工作原理，包括基于材料及黏合剂的喷墨生物打印系统、基于光聚合生物打印系统、基于挤压式的喷嘴生物打印系统，其中基于光聚合的打印方式又包括立体光刻、双光子聚合及激光诱导转移，各种工作原理的3D打印技术在水凝胶方面都有广泛的应用。

1.1 喷墨生物打印系统

喷墨打印系统作为一种非接触式的成型打印技术，是定制聚合物沉积领域的关键所在。通过从计算机上获取数字信息，将生物墨水及黏结剂等以液滴的形式喷射至指定的位置，从而成型目标模型样品[图1(a)][2]。喷墨打印一般分为按需喷墨系统和连续喷墨系统，在连续喷墨系统中，连续的墨水在压力下从打印头中流出，产生喷射，然后在电信号控制运动方向的作用下，射流可以分解成小液滴。在液滴按需喷墨系统中，驱动器可以产生脉冲，并通过压电或热磁头将具有预定墨量的单个液滴喷射出来。喷墨打印机能够高保真地将多种材料打印到相关尺寸的结构中，分辨率为50～500 μm，适合制造复杂的支架，已被用于各种组织工程支架等生物材料的打印[3]。

1.2 光聚合生物打印系统

基于光聚合生物打印技术是以可光交联的的水凝胶材料为基体，以特定波长的光引发特定或整体位置水凝胶发生交联聚合从而构筑目标组织工程支架、模型等的一种打印方式。目前光聚合进行生物打印的方式主要包括立体光刻技术、双光子聚合技术及激光诱导转移技术。

立体光刻（SLA）技术是第一种商业化的3D打印技术，光固化的水凝胶或其他聚合物溶液经紫外或激光的投影光源照射，通过逐层的固化叠加形成所预先设定的模型[4]。双光子聚合技术是采用近红外飞秒脉冲激光作为光源，制备分辨率高的三维结构模型，该技术具有良好的空间选择性，但双光子吸收要求特定的物质和极高的能量密度，只有当光强达到一定值时，才会出现明显的双光子吸收效应[5]。激光诱导转移技术[图2(b)]是激光透明供体被涂上一层固体、液体或黏贴层，当激光脉冲穿过供体载玻片并被涂层吸收，当入射能量超过某一特定阈值时，生物墨水材料将从涂层中喷射出来，并别接收板接收，从而形成复杂的高分辨率2D和3D图案(10～100 μm分辨率)[6]。

1.3 挤压式生物打印系统

基于挤压式的水凝胶3D生物打印[图1(c)]是制备负载细胞结构研究和应用最广泛的方法，该技术是将生物墨水放置在一次性医用塑料注射器中，然后通过气动或机械(活塞或旋转螺杆)将墨水按预定轨迹排布于基板上从而逐层呈现目标模型，该技术非常适合于支架制造和水凝胶加工[7]，分辨率在μm到cm范围内。

2 3D生物打印水凝胶

ECM是一个以细胞为中心的复杂微环境，主要由蛋白质、糖胺聚糖和其他可溶性分子共同作用而组成的。ECM可以为细胞微环境提供动态的生化和生理信号，这是细胞生理和命运的关键决定因素[8]。水凝胶的结构与ECM较为相似，通过模拟ECM，水凝胶不仅能够为细胞驻留提供结构支持，还能够提供各种预定义的生化信号（细胞因子、生长因子、细胞黏附肽等）和生理信号（结构、刚度、降解等）来调节细胞命运[9]。考虑到水凝胶材料的可打印性能，用于3D生物打印的水凝胶材料需满足首要的两个因素是流变性能和交联机制，其中流变性能包括黏度、剪切变稀、屈服应力等，而交联机制指打印的水凝胶需能够进行物理、化学或二者结合的交联。目前用于3D生物打印的水凝胶主要包括单组分水凝胶、互穿网络水凝胶、超分子水凝胶、纳米复合水凝胶及复合水凝胶。

2.1 单组分水凝胶

单组分水凝胶是指单一的天然水凝胶或改性水凝胶在引发剂等的存在下自身形成水凝胶，该类水凝胶已被广泛的应用于3D生物打印中，较为典型的为基于海藻酸钠、明胶及胶原的水凝胶。Schuster等[10]利用聚乙二醇对明胶衍生物进行改性制备一种光固化的骨替代材料，该材料具有可以调节的机械性能及良好的生物学性能。Rhee等[11]开发了一种高密度胶原水凝胶的3D生物打印方法，并对打印结构的几何保真度、细胞活力和机械性能进行表征。

2.2 互穿网络水凝胶

互穿网络（ⅠPN）水凝胶是指两种及两种以上的水凝胶组分通过网络互穿的形式缠绕在一起而形成的一种独特的水凝胶共混物，该共混物可以有效的实现两种或多种水凝胶的性能互补，同时ⅠPN的特殊细胞状结构、界面互穿、双相连续等形态特征，又使得它们在性能或功能上产生特殊的协同作用，防止相分离，极大地提高了水凝胶的机械强度及可响应性。Bakarich[12]基于海藻酸盐和丙烯酰胺的离子共价纠缠水凝胶，该水凝胶可以进行挤压印刷和原位光聚合，具有良好的可打印性能。Lopez-Marcial等[13]通过海藻酸盐和琼脂糖的结合，制备了一种海藻酸琼脂糖ⅠPN水凝胶，以5%（W/V）（琼脂糖与海藻酸盐的比例为3:2）制备的海藻酸琼脂糖复合材料在28 d的的细胞培养中，细胞的存活率达到了70%。Lim[14]等在甲基丙烯酰化明胶（GelMA）中加入[ω(型胶原)=0.6%)改变了GelMA的流变行为，更好地控制了打印保真度。

2.3 超分子水凝胶

超分子水凝胶（SHGs）是由低分子量分子、低聚物或聚合物组成的网络，这些聚合物通过非共价相互作用在几分钟到几小时内自组装成更大的纤维状或某种有序的上层结构，然后通过共价或非共价作用交联，纠缠，从而形成的一种自组装水凝胶。该类基于主客体相互作用的水凝胶可用于打印梯度生物结构或通过分子识别的方式自组装为更复杂的水凝胶生物结构，具有可控调节的物理、化学及生物学特性。Li等[15]人开发了一种基于DNA水凝胶为生物墨水的快速原位多层生物打印方法，该DNA生物墨水包含多肽共轭和DNA互补链接器两种水凝胶，具有良好的自愈合能力和机械强度，并对蛋白酶和核酸酶有响应。

2.4 纳米复合水凝胶

纳米复合水凝胶是一种结合纳米粒子添加的水凝胶，水凝胶中纳米颗粒的加入可以改变水凝胶基体的物理、化学及生物学性能，可以赋予水凝胶更良好的打印性能、机械性能、热稳定性能等。Nadernezhad等[16]通过在琼脂糖生物墨水中添加纳米硅酸盐，改善了琼脂糖生物墨水流变、凝胶化行为及可打印性能，并可提高被封装细胞的代谢活性。Zhu等[17]将金纳米棒嵌入GelMA中而制备一种纳米复合生物墨水用于心脏组织的3D打印，改善了细胞间的耦合，并促进生物打印结构间的同步收缩并利于细胞更好的黏附。

2.5 复合水凝胶

复合水凝胶是由多种水凝胶相互作用形成的混合水凝胶，该类水凝胶可以高分辨率高精度的再现复杂的ECM微结构，多材料多细胞的结合可以打印出具有多种形态、结构、力学性能和多功能成分的复杂三维生物结构，建立具有仿生结构和功能特性的多重生物结构。Miri[18]等开发了一种基于SLA技术的生物打印平台，用于非均相水凝胶结构的多材料制备，利用聚乙二醇二丙烯酸酯和GelMA制备了水凝胶结构证明该平台的多材料打印能力（如图2）。Rutz等[19]利用凝胶剂（明胶、GelMA、四臂聚乙二醇胺）和双反应活性位点处于尾端的聚乙二醇（PEGX）化学交联剂开发了一种生物墨水，PEGX交联可以提供可定制的黏度和生物降解性，而不危及细胞活性。

3 水凝胶3D生物打印在组织工程中的应用

随着水凝胶3D生物打印技术的发展及水凝胶材料的不断丰富，以水凝胶为基体进行个性化组织器官模型、芯片等的打印正在快速的发展。基于水凝胶的3D生物打印在组织工程的应用上主要包括三个方面：其一是组织器官的再生，其二为体外组织器官模型的构建用于辅助药物开发及筛选等，其三为病变组织或器官的体外还原用于辅助治疗。

3.1 组织器官的再生

组织器官的再生概念自1993年Robert Langer[20]提出后，经过近30年的发展已经逐步渗透到组织工程的各个环节，目前水凝胶3D生物打印组织器官的再生在骨修复、软骨再生、脊髓损伤与修复、皮肤再生、血管再生等多方面得到了应用[5,21]。Batzayaa 等[22]基于挤压式3D生物打印设计了一种血管化骨组织结构，以模拟整个骨结构，在GelMA水凝胶中具有不同成分的圆柱形细胞载体水凝胶共培养血源性人脐静脉内皮细胞和骨髓源性人间充质干细胞，在构建物的一侧使用较高机械强度以及使用封装的二氧化硅纳米血小板来诱导成骨，并用化学偶联的血管内皮生长因子来刺激血管生成，7 d后，可灌注血管通道在生物打印结构出现，并且打印的结构件在体外可以稳定21 d。Kesti等[23]开发了一种由海藻酸盐和结冷胶组成新型软骨特异性生物墨水，通过共挤出的方式制备的复杂软骨结构件具有良好的生物相容性。Koffler等[24]通过微尺度连续投影打印（μCPP）制造复杂的中枢神经系统结构，用于脊髓再生，μCPP可在1.6 s内打印适合啮齿动物脊髓尺寸的3D仿生水凝胶支架，该水凝胶支架在啮齿类动物完全脊髓损伤的体内部位形成新的神经传递。Koch等[25]通过激光3D生物打印技术在胶原水凝胶中呈现了成纤维细胞和角质形成细胞的三维空间排列，制造多细胞3D皮肤移植物。Kim等[26]提出了一种新的3D细胞打印平台，以打印复杂的皮肤解剖结构，该平台可以设计可灌注的皮肤血管化3D人体皮肤的打印，由表皮、真皮和下皮层组成的全层皮肤模型的成功打印显示了原生人类皮肤再现的可能。

3.2 体外组织/器官模型的构建

3D生物打印与组织工程及再生医学的紧密结合，于体外构建组织器官模型及芯片平台，在疾病救治、癌症研究、药物开发及筛选等方面的具有广阔的前景。3D生物打印制备的组织器官芯片可以通过对组分的精确控制来模拟组织或器官复杂的基质环境，同时能够在组织工程结构支架中精确定制细胞、ECM、生物材料和生长因子的位置，为不同的生物医学应用创建仿生组织和器官模型。另外，3D生物打印与微流控技术相结合，可以创建复杂的流通通道/腔室和具有3D异质结构、细胞放置和组织特异性的功能性生物结构以更接近真实的组织或器官。Colosi等[27]利用海藻酸盐和GelMA的混合物开发一种低黏度的生物墨水，结合微流控平台组成精确和控制沉积的微流体系统，该系统可以促进细胞在生物结构体内部的传播和迁移，基于此创建了非均匀3D体外组织模型，以模拟原生组织，可用于再生医学或药物开发。Cao等[28]制备了一种由3D生物打印中空血管和淋巴管组成的改进肿瘤芯片模型，通过3D生物打印血管和淋巴管的不同组合，显示了生物分子或抗癌药物的不同扩散谱，预示着这种体外肿瘤模型可以模拟药物在肿瘤微环境中的转运，从而提高抗癌药物的筛选准确性。

3.3 术前准备

随着个性化、精准化医疗的提出与深入，3D打印在辅助医生进行术前准备方面已逐渐被应用。通过CT扫描，定位病变部位，3D打印患者病变结构来开发针对患者的治疗方案，可以协助医生在手术前模拟所有复杂的手术过程，预测可能的手术中事故或并发症[29]。利用水凝胶进行3D生物打印，可以创建与原生活体相似的血管网络软组织和器官模型，3D打印的坚硬水凝胶甚至可以用来制造硬组织，如软骨、肌腱和韧带。机械性能和功能特征更接近人体组织结构的水凝胶3D模型的应用较普通模型更有利于手术的成功。

4 水凝胶3D生物打印的趋势

水凝胶3D生物打印的发展主要集中在新材料的开发及应用方面的拓展，当前水凝胶的种类还较少，而且功能比较单一，新型水凝胶材料的开发的是重中之重。新材料的应用也会拓宽水凝胶3D生物打印的应用领域，与微电子、人机交互方面的结合正在被关注。

4.1 生物3D水凝胶材料的开发

伴随着人工智能的快速发展，智能型3D生物打印水凝胶的开发已成为3D打印发展的趋势。智能型水凝胶通常指在光、电、热、渗透压等外界刺激下，水凝胶可以在形式及功能上发生自我转换，该类水凝胶通常也被称为4D水凝胶[5]。随着人类对组织发育和愈合的生物学过程理解扩展，刺激响应性的信息将被整合到组织支架中，使特定的信号在适当的空间和时间方式传递，如何合理的可控设计水凝胶的结构、反应的方式、细胞定向的表达行为将推动3D生物打印水凝胶的发展。

4.2 水凝胶3D生物打印的应用

水凝胶材料及3D打印技术的发展，使水凝胶材料的应用在不断的延伸，当前水凝胶3D生物打印在可穿戴电子、仿生软机器人等方面受到了大的关注。结合水凝胶材料良好的可拉伸性、生物相容性、离子导电性、与生物组织的相似性及3D生物打印的个性化精确定制特性，水凝剂3D生物打印可以创建具有复杂结构的可定制可穿戴柔性电子设备（如图3）[5,30]。基于机械强度和刺激响应性水凝胶材料的设计和开发可以有效帮助基于水凝胶的仿生软机器人技术的快速发展，3D打印可以定制设计并一步制备具有复杂结构的高分辨率软机器人，这种仿生机器人在药物输送、药物筛选、癌症治疗等方面将发挥巨大的作用。Bashir等[31]开发了一种非对称物理设计的水凝胶生物机器人，由工程骨骼肌提供动力来移动，电刺激能够触发骨骼肌内的C2C12细胞收缩和水凝胶生物机器人的运动，最高速度超过每分钟1.5个体长(～156 μm·s-1)，这种生物机器人可以在系统中集成细胞组件，从而实现了广泛的生物医学应用。

5 总结及展望

水凝胶以其良好的仿生性能在3D生物打印组织工程中的应用越来越广泛，本文从当前水凝胶3D生物打印的常用技术、用于组织工程方面水凝胶的材料以及组织工程中水凝胶3D生物打印的应用方面进行了阐述，同时介绍了水凝胶3D生物打印在材料开发、应用拓展等方面的发展需求。随着国家个性化医疗、精准化医疗不断深入，水凝胶3D生物打印将会起到越来越重要的作用。