消风宣窍汤对变应性鼻炎豚鼠免疫调节作用研究

夏 晨 汪受传 李 萌 魏肖云

变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是由于变应原刺激特应性个体，导致鼻黏膜产生IgE，进而使得各种免疫细胞共同作用的I 型变态反应，属于祖国医学中“鼻鼽”范畴。近年来，AR 患病率逐渐增加。目前西医多使用鼻用糖皮质激素、第二代抗组胺药等来控制AR症状，但停药后症状容易复发；而中药治疗既可减轻AR症状，还能改善机体免疫功能，受到越来越多学者的关注。汪受传教授从“伏风”论治，自拟消风宣窍汤治疗小儿鼻鼽，临床效果好，不良反应少，有独特的优势[1]。前期研究已经证实，消风宣窍汤治疗儿童AR的作用机制与免疫调节相关[2]。本实验以AR 模型豚鼠为实验对象，进一步探究其免疫调节的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物40 只Hartley 豚鼠，体重（300±35）g，清洁级，4～5 w龄，雄性，来源于南京中医药大学实验动物中心，动物许可证号为SCXK（苏）（2012-0008）。

1.2 药品与试剂（1）消风宣窍汤（由炙麻黄3 g、桂枝3 g、辛夷3 g、苍耳子6 g、五味子6 g、乌梅6 g、胆南星6 g、广地龙6 g组成)，来源于南京中医药大学附属医院中药房制成浓缩滤液，生药含量为1.05 g/mL；（2）氯雷他定来源于上海先灵葆雅制药有限公司（批号为10KRXF1047），规格为10 mg/片，用蒸馏水稀释为0.1 g/mL；（3）卵白蛋白（OVA)来源于美国Sigma 公司（批号为326A05）；（4）氢氧化铝凝胶来源于上海美兴化工有限公司（批号为2008050）；（5）酶联免疫吸附(ELISA)检测试剂盒来源于美国R＆D 公司（批号为201304）。

1.3 仪器与设备DMIL 型倒置显微镜来源于德国Leica 公司；EXL 800 型酶标仪来源于美国BioTek公司。

1.4 分组、建模及给药40只Hartley 豚鼠被随机分成正常组、模型组、消风宣窍汤组、氯雷他定组，每组10 只。在正式试验之前，将每只豚鼠鼻腔分泌物行Wright染色，观察嗜酸性粒细胞（EOS）的分布情况，发现染色结果均为阴性。除正常组外，其余3 组采用OVA 模型的建立方法[3]制备豚鼠变应性鼻炎模型，并用鼻部分泌物EOS分布情况、鼻部症状行为学评分评估造模成功与否（局部致敏30 min，若鼻腔分泌物涂片EOS 阳性且鼻部症状行为学评分总分>5 分，表示AR 豚鼠模型构建成功）。待造模成功，按照1岁儿童临床等效剂量并根据《药理试验方法学》公式进行人和动物给药剂量的换算，消风宣窍汤组等效剂量为14 g/（kg·d），氯雷他定组等效剂量为1.88 mg/（kg·d）。给药方式为消风宣窍汤组、氯雷他定组每只豚鼠每8 h灌胃1次，每日2次；AR模型组、正常组则按照相同次数、方法给予相等量的生理盐水。共灌胃7 d。

1.5 观察指标

1.5.1 鼻部行为学观察 给药7 d 后，对豚鼠给予致敏物，给致敏物即开始计时，共计时30 min，观察各组豚鼠鼻部症状、行为，根据过敏反应行为的评分标准评分[3]：喷嚏次数1～3 次为1 分，4～10 次为2 分，≥11次为3分；擦鼻次数1～4次为1分，4次以上为4分；清涕流至前鼻孔为1 分，超出前鼻孔为2 分，涕流满面为3分。

1.5.2 鼻黏膜分泌物阳性细胞计数 鼻部行为学观察后，将每只豚鼠鼻腔分泌物涂片滴加Wright 染色液，油镜下每张涂片观察10 个视野(视野倍数：10×40)，分别计算嗜酸性粒细胞(EOS)和肥大细胞(MC)的比率。

1.5.3 免疫指标 鼻黏膜分泌物涂片后，麻醉豚鼠，采颈动脉血5 mL，以3000 r/min离心10 min，分离出血清，并于-70 ℃冰箱保存。用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）分别检测四组豚鼠的血清IgE、组胺及Th1、Th2、Th17细胞相关细胞因子水平。

1.5.4 病理指标 豚鼠取血后处死，取出其鼻腔黏膜组织，在4%多聚甲醛溶液中固定72 h，依次经过75%-85%-95%-100%梯度酒精脱水、二甲苯透明、常规石蜡包埋。以4～5 μm切片，最后行HE染色，观察高倍镜下各组豚鼠的鼻黏膜组织学改变情况，并进行病理变化分级评分[3]。

1.6 统计学方法采用SPSS 16.0 统计软件进行处理。数据以均数±标准差(-x±s)表示。采用单因素方差分析进行组间比较，采用Bonferroni 法进行两两比较。P<0.05表示有统计学差异。

2 结果

2.1 豚鼠死亡情况实验过程中，共死亡10 只豚鼠。正常组不明原因死亡1只；模型组因鼻塞严重死亡2只；消风宣窍汤组因鼻塞死亡1只；氯雷他定组因鼻塞死亡1 只、不明原因死亡1 只。治疗结束后各组豚鼠数量如下：正常组9 只，模型组8 只，消风宣窍汤组9只，氯雷他定组8只。经比较，各组豚鼠死亡数量差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2 各组豚鼠鼻部症状行为学评分比较模型组的各项症状及症状积分明显高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，消风宣窍汤组与氯雷他定组的各项症状及症状积分均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；而消风宣窍汤组与氯雷他定组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 各组豚鼠鼻部症状行为学评分比较（分，）

表1 各组豚鼠鼻部症状行为学评分比较（分，）

注：与正常组相比，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05

2.3 各组豚鼠鼻黏膜分泌物阳性细胞计数比较和正常组比较，模型组豚鼠鼻腔分泌物中EOS、MC计数均有明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。和模型组比较，消风宣窍汤组和氯雷他定组两种阳性细胞计数值均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；而消风宣窍汤组与氯雷他定组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2 各组豚鼠鼻黏膜分泌物EOS、MC计数比较（）

表2 各组豚鼠鼻黏膜分泌物EOS、MC计数比较（）

注：和正常组相比，aP<0.05；和模型组比较，bP<0.05

2.4 各组豚鼠血清IgE、组胺水平比较模型组豚鼠血清IgE、组胺水平较正常组明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。和模型组相比，消风宣窍汤组与氯雷他定组豚鼠血清IgE、组胺水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）；消风宣窍汤组较氯雷他定组下降更明显，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 各组豚鼠血清IgE、组胺水平比较（）

表3 各组豚鼠血清IgE、组胺水平比较（）

注：和正常组相比，aP<0.05；和模型组比较，bP<0.05；和氯雷他定组比较，cP<0.05

2.5 各组豚鼠Th1、Th2、Th17细胞相关细胞因子水平比较与正常组相比，模型组豚鼠血清中的NFκB、IL-4、IL-6、IL-17 水平均明显升高，IFN-γ、IL-12水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组相比，消风宣窍汤组及氯雷他定组豚鼠血清中NFκB、IL-4、IL-6、IL-17 水平均显著降低，IFN-γ、IL-12水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。消风宣窍汤组与氯雷他定组各细胞因子水平相比，差异无统 计学意义（P>0.05）。见表4。

表4 各组豚鼠血清中Th17、Th1、Th2 细胞相关细胞因子水平比较（）

表4 各组豚鼠血清中Th17、Th1、Th2 细胞相关细胞因子水平比较（）

注：和正常组相比，aP<0.05；和模型组比较，bP<0.05

2.6 各组豚鼠病理组织评分比较正常组的豚鼠鼻黏膜组织结构基本正常，HE 染色未见EOS。模型组鼻黏膜组织上皮细胞坏死脱落或化生，固有层组织水肿，大量EOS浸润，腺体增生明显，病理组织评分明显高于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）。消风宣窍汤与氯雷他定组的上述病理学改变均有所减轻，鼻黏膜组织炎性反应明显减轻，黏膜血管轻度扩张，稍有水肿，病理组织评分明显低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。消风宣窍汤组与氯雷他定组的病理组织评分比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表5。

表5 各组豚鼠鼻黏膜病理组织评分比较（分，）

表5 各组豚鼠鼻黏膜病理组织评分比较（分，）

注：和正常组相比，aP<0.05；和模型组比较，bP<0.05

3 讨论

AR 已经成为儿童主要呼吸道慢性炎症性疾病，有报道[4]显示2016 年美国儿童变应性鼻炎的自报患病率达到40%，确诊患病率为13%。2020年内蒙古12个市6～18岁儿童青少年变应性鼻炎的标化自报患病率为18.20%，标化确诊患病率为9.71%[5]。尽管有很多治疗AR 的西药，如抗组胺药、鼻用糖皮质激素、鼻减充血剂和肥大细胞稳定剂等，但长期治疗的不良反应多，复发率高。因此，对改善过敏症状的新方法或替代方法的需求日益增加。临床研究显示消风宣窍汤不仅可治疗患儿变应性鼻炎发作症状，而且可以逐步改善患儿过敏体质，减少鼻鼽反复发作，长期应用不良反应少[6]，但其作用机制尚不清楚。本研究通过实验研究初步探讨了消风宣窍汤治疗AR的免疫作用机制。

AR 是以IgE 明显升高为特征的I 型变态反应疾病，发病机制复杂，重要原因之一为Th1/Th2 平衡失调。纠正Th1/Th2细胞的分化、Th1/Th2细胞因子分泌的失衡，可有效抑制变应性炎症反应。IL-4为Th2细胞重要的特征因子之一，可以诱导免疫球蛋白IgM至IgE 的同型转换，使得MC 的脱颗粒作用增强。通过Pearson相关性分析表明，AR感染后血清IL-4水平与其SFAR、VAS 评分以及外周血清IgE 均呈正相关[7]。IFN-γ 能激活巨噬细胞，促进静止的Th0 细胞向Th1细胞的分化，还能抑制Th2 细胞的增殖[8]。IL-4 和IFN-γ 的表达异常提示Th 细胞的分化偏移。IL-4 逐渐增多和IFN-γ 减少，乃是变应性鼻炎机体内IgE 合成增多的主要机制，INF-γ 在AR 炎症早期发生可能起主导作用，而IL-4在晚期发展可能发挥主要作用[9]。IL-6是Th2细胞分泌的另一种重要的细胞因子，参与多种靶细胞黏附和集聚，并具有重要的免疫调节功能，可提示气道炎症的活跃程度，促进气道炎症的发生和气道结构重建。研究证实IL-6 在CRS 的鼻腔黏膜高表达[10]。IL-12 是诱导Th0 向Th1 细胞分化的重要因素，可促进产生Th1型细胞因子，并抑制Th2型细胞因子，还可以通过抑制IL-4发育从而拮抗Th2型细胞应答。IL-12为诱导产生IFN-γ的最主要的细胞因子[11]。当血清IL-12过高表达时，EOS分化、生成得到抑制，使进入靶组织的EOS 和T 细胞减少，进一步抑制由IgE 介导的I 型变态反应，改善AR 症状[12]。NFκB参与炎症和免疫反应，并起枢纽作用，可调节各类炎症递质和免疫因子之间的级联放大连锁效应，因此抑制其激活可有效防止AR的产生[13]。NF-κB表达增加，可诱发Th2 细胞因子IL-4 等分泌，从而促进B 淋巴细胞合成IgE，同时增强EOS 的黏附聚集[14]。Th17细胞可上调Th2 细胞介导的嗜酸性气道炎症，IL-17是其分泌的特征性细胞因子，可增强气道平滑肌收缩和气道上皮细胞对变应原的通透性[15]。IL-17可增加气道上皮细胞黏液的表达，并通过NF-κB依赖通路激活黏液蛋白基因表达和蛋白生成[16]。炎症性疾病和自身免疫性疾病发生可能与IL-17过度产生有关。

本研究显示，消风宣窍汤治疗后可减轻豚鼠流涕、擦鼻、喷嚏等AR 症状，显著减少鼻腔分泌物中EOS和MC计数，降低血清中IgE、组胺水平，证实了消风宣窍汤可以减轻局部免疫反应，起到抗炎、抗过敏的作用，并可以改善鼻黏膜的病理损伤。其中消风宣窍汤治疗后豚鼠血清IgE、组胺水平下降较氯雷他定组更为明显，提示消风宣窍汤抗过敏方面可能更有优势。AR感染前，各细胞因子之间相互联系、协调及作用，Th1 和Th2 则通过这些细胞因子的变化保持着动态平衡。临床证实AR感染后，存在Th1/Th2平衡被破坏及Th17 细胞比例升高的情况[17]。本研究通过豚鼠感染前后细胞因子情况的对比，得到了类似的结论，并通过观察Th17、Th1、Th2细胞分泌的不同细胞因子的水平变化，证实消风宣窍汤治疗后可以降低豚鼠血清Th2 相关细胞因子IL-4、IL-6 含量，增高Th1 分泌IFN-γ、IL-12 相关细胞因子的含量，同时抑制了血清NF-κB、Il-17 表达，其细胞因子的水平变化较氯雷他定组无显著差异。通过本次实验研究，推测消风宣窍汤治疗变应性鼻炎模型可能通过降低机体Th2 相关细胞因子含量，同时升高Th1 相关细胞因子含量，来抑制Th2 免疫反应，增强Th1 的免疫反应，纠正Th1/Th2 免疫失衡来治疗疾病，也提示调节机体中Th1/Th2、IL-17 免疫平衡状态成为该疾病新的治疗方向[18]。