非洲猪瘟病原学检测技术研究进展

王 翠，许宗丽，黄溢泓，覃艳然，梁竞臻，周师师，刘针伶，黄小武，马小蓉，李志源，严斯刚

（柳州市动物疫病预防控制中心，广西柳州 545005）

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染猪引起的一种热性急性传染性疫病，临床症状表现为体温高热、皮肤充血、多器官出血及流产等症状[1]。ASFV 是非洲猪瘟病毒科（Asfarviridate）的唯一一种病毒，也是唯一一种虫媒传播的双链线性DNA 病毒，以直接或间接接触以及软蜱吸血途径传播，仅感染猪科动物（不同生长阶段、品种的猪均易感）[2]。ASFV 是大型、似六角形、复杂的二十面体带囊膜的双链线性DNA 病毒，直径172～260 nm，基因组全长170～194 kb，其病毒颗粒是由3 万余个蛋白亚基，17 280 种蛋白质组装成的球形颗粒，是目前解析近原子分辨率结构中最大的病毒颗粒[3]。ASFV 根据病毒是否具有红细胞吸附特性，已鉴定出8 个血清群，依据编码p72 蛋白的B646L基因的3′端序列，目前全球已鉴定出至少24 种基因型，其中欧洲流行I 型和II 型[4]。强毒力基因II 型2018 年传入我国，随后蔓延至全国，2021 年2 月Sun 等[5]在我国发现基因II 型自然低毒力毒株，其基因序列发生了不同程度的突变或缺失，导致毒株致病性降低，有明显的残留毒力，引起的临床症状也具有明显的隐蔽性；2021 年10 月Sun 等[6]从山东和河南两省猪场临床发病猪样品分离出两株基因I 型毒株，经动物攻击试验发现，其表现出低毒力和有效传播能力，并可导致轻度感染和慢性疾病，而感染这些低毒力毒株的猪不断排出病毒并出现低水平的病毒血症，排毒及病毒血症规律性较差，这给ASF 的早期诊断和防控带来巨大障碍。为更好地给ASF 早期诊断和防控提供帮助，就当前的ASFV 病原学检测技术研究进行了概述。

1 活病毒检测

活病毒检测主要有病毒分离（virus isolation，VI）和红细胞吸附试验（hemadsorption，HAD）。VI 鉴定结合HAD 是世界动物卫生组织（OIE）确诊ASF 的“金标准”之一。VI 是将ASFV 从猪血液、肺（肺泡）单核细胞或巨噬细胞中分离出来，镜下观察是否有细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）；HAD 是根据红细胞聚集在ASFV 感染的巨噬细胞周围，观察细胞表面是否有“玫瑰花环”或“桑葚状”现象[7]。但这些方法试验周期较长，所需设备昂贵，对技术人员素质、实验室生物安全条件等方面要求较高，必须在具有生物安全三级以上实验室中进行，且目前只有少数实验室能从事ASFV 分离、鉴定、活病毒培养、动物接种试验等，因此并不适用于现场检测，通常适用于ASFV 致病机制和分子生物学表征的研究及疫苗的研发。

ASFV 分离最早使用猪原代巨噬细胞，且必须是猪身上的新鲜分离的血液才行，而大多数兽医诊断实验室通常是不易获得的。Rai 等[8]从非洲绿猴肾上皮细胞中分离到商业化的细胞系MA-104（猴胚胎肾细胞），能从不是新鲜的血液样品中检测ASFV，其灵敏度与原代猪巨噬细胞相当。近期又有文献报道[9]，ASFV 能在ZMAC-4（胎猪肺巨噬细胞）、WSL（野猪肺细胞）和IPKM（猪肾巨噬细胞）中高效复制，这些可替代的细胞能节省大量的前置时间。而1963 年Tubiash 等[10]在西班牙首次发现ASFV 不吸附红细胞。2021 年Sun 等[5]在我国分离出22 株自然变异株，其中有11 株因基因突变或缺失阻止病毒翻译完整的CD2v 蛋白，导致病毒粒子失去吸附红细胞表型的能力。因此，不具有红细胞吸附现象的ASFV 毒株，并不适用于此方法来进行鉴定，进一步确诊需要对病毒分离培养物采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）、实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）等方法进行检测鉴定。

2 病毒核酸检测

病毒核酸检测是针对ASFV 核酸序列的，常用方法有PCR、qPCR、微流控芯片法、等温扩增技术，其中PCR 和qPCR 是OIE 推荐的首选确诊技术。不同方法有其各自的特点，具体见表1。

表1 常用ASFV 核酸检测方法比较

2.1 PCR

从发明到现在，PCR 方法被不断改进和优化，已成为实验室病原学检测常用方法之一，也是OIE推荐的ASF 诊断方法之一。Agüero 等[11]针对编码p72 蛋白的B646L基因保守区域设计了一对特异性引物，建立了ASFV PCR 检测方法。该方法扩增片段大小为257 bp，使用的引物是OIE 推荐使用的引物之一。为了建立一种便捷、快速且精准的ASFV 检测方法，李艳等[12]根据ASFV p72 蛋白基因序列设计特异性引物，建立了ASFV 锁核酸修饰引物PCR 检测方法。该方法具有良好的敏感性和特异性，检测灵敏度可达3×101copies/μL，比常规PCR 方法提高了100 倍，比qPCR 方法提高了10 倍。用该方法检测了72 份临床样品，其结果与OIE 推荐的qPCR 方法检测结果一致，符合率为100%。

因动物疫病的复杂化，ASFV 多与其他病原混合感染，引起的临床症状不典型，无法与其他疫病区别。为了快速诊断猪只感染状况，Liu 等[13]针对ASFV、猪瘟病毒和非典型猪瘟病毒的高度保守区域设计了3 对特异性引物，建立多重PCR 检测方法用于临床样本的鉴别诊断。该方法特异性强、灵敏度高，且对样品保存方式要求较低，但对技术人员操作要求高，不适于现场检测。

2.2 qPCR

相比于普通PCR，qPCR 在普通PCR 基础上引入了光谱技术，通过荧光信号的强弱变化，定量实时监测PCR 反应的整个过程，最后通过扩增曲线和反应特异性扩增产物的量（Ct）来判断样品的阴阳性。该方法的特异性、灵敏性都超过普通PCR，且自动化程度高，不易污染，是目前公认的金标准之一。

为了防止基因错配而导致检测不准确，Yang等[14]针对B646L和B438L基因的保守区设计了2组特异性引物和2 个TaqMan 荧光探针建立了双重qPCR。该方法的检测限为10 copies/μL。用180 份ASFV 临床感染样本，将其与商品化试剂盒进行检测比较，结果两种方法具有良好的一致性（98.3%），因而该方法可以极大提高ASFV 检测效率。为了鉴别检测ASFV 的野生型毒株和基因缺失毒株，韩勇军等[15]根据ASFV 的P72、CD2v、MGF360-14L基因保守序列设计了特异性引物和探针，建立了一种可以同时检测上述4 种基因的多重荧光定量PCR 方法。该方法的最低检测限为100 copies/mL。用该方法与ASFV 核酸检测试剂盒对35 份临床样品进行检测，结果阳性符合率为100%。该方法的建立对ASFV 的鉴别检测、病原流行病学调查等具有重要意义。为了快速检测出越南ASFV 流行毒株，Trinh 等[16]针对编码p54 蛋白的E183L基因建立一种新型qPCR 方法。该方法检测限为2.63 copies/μL，能够检测根据P72基因分型的I、II 和V 的15 种不同ASFV 参考毒株，为ASF 防控提供了一种新的检测方法。

qPCR 检测技术灵敏，极其微量的污染即可造成假阳性，所以对于PCR 实验室，应根据条件实施试剂准备区、样本制备区、产物扩增区等分区管理，同时也要注意由于引物和探针的错配及选择的试剂盒不够敏感等原因导致的假阴性结果，所以一次检测的阳性和阴性结果均需谨慎评价，最终确诊需结合临床和流行病学指标，必要时可采取基因测序或者其他平行试验[17]。

2.3 微流控芯片法

微流控芯片技术是将样品前处理、反应、分离及检测等过程集成到几平方厘米的芯片上，自动完成分析全过程，实现了分析微型化、自动化、集成化和便携化的一种新技术[18-19]。Jia 等[20]针对ASFV 的B646L基因设计了一对特异性引物，结合探针建立了纳米微流控数字PCR。该方法的检测限为30.19 copies/mL，比OIE 推荐的qPCR 高约33 倍。用该方法与OIE 推荐的qPCR 同时检测69份灭活的临床血清样本，发现两种方法具有良好的一致性（91.30%）。为评估微流控芯片法在ASFV核酸快速检测中的效果，邵靓等[21]用ASFV 微流控芯片快速检测试剂盒和市场上ASFV qPCR 检测试剂盒，对43 份临床样本进行检测比对，发现微流控芯片法可以在15～30 min 内检出，最低检出限为2.5 copies/uL，与qPCR 具有良好的一致性（97.67%）。该方法具有样品消耗少、检测速度快、操作简便、便于携带等优点，但需要特定的设备，检测成本高，难以被推广。

2.4 等温扩增技术

等温扩增技术是一种新兴的分子生物学核酸检测方法，有环介导等温扩增（loopmediated isothermal amplif ication，LAMP）、重组酶聚合酶等温扩增（recombinase polymerase amplif ication，RPA）、重组酶介导等温扩增（recombinase aided amplif ication，RAA）和酶促重组酶扩增（enzymatic recombinase amplif ication，ERA）4 种。等温条件下，在特异性引物、酶等物质的作用下实现体外核酸扩增，再结合琼脂凝胶电泳、实时荧光和测流层析试纸条以及规律成簇的间隔短回文重复（clustered stered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）4 种方式，可呈现检测结果。Yang 等[22]针对p72 蛋白基因建立了LAMP 结合CRISPR Cas12a 系统的ASFV 便携式检测方法，检测限可达7 copies/μL，检测时间只需30 min；反应结束后可在蓝光（440～485 nm）下肉眼观察到荧光，与临床样本的qPCR 检测结果具有较好的一致性。Ceruti 等[23]基于ASFV p72 蛋白编码基因B646L建立了RPA 检测方法，该方法只需42 ℃反应15 min，最低检测限为3.5 copies/μL，与qPCR 具有较好的一致性。为了节约时间和耗材以及方便基层人员和应急情况下的检测，Wang 等[24]将RPA与侧流技术相结合，建立了一种用于ASFV 定点诊断的金纳米颗粒试纸条，称其为侧流基因检测（lateral f low gene assay，LFGA）。LFGA 在反应温度较低（37～42 ℃）、反应时间较短（30 min）的条件下，能特异性识别ASFV 和猪瘟病毒感染血样中的ASFV，检测限可达102copies/μL，与琼脂糖凝胶电泳结果相当。LFGA 实现了快速RPA 扩增后产物的可视化观察，整个过程不需要任何昂贵的仪器，使ASFV 在有限的环境中实现了点对点诊断。为了克服传统诊断方法耗时长、要求高、不直观等缺点，Fu 等[25]针对p72 蛋白基因建立RPACas12a 荧光检测法用于ASFV 的定点检测，其最低检测限7 copies/μL，20 min 内即可进行可视化检测。曾宇晨等[26]根据ASFVB646L、EP402R基因和多基因家族成员MGF360/505基因保守序列，设计特异性的ERA 探针和引物，建立了42 ℃等温条件下检测ASFV 的ERA 方法，对应基因建立的3种检测方法分别在16、7 和13 min 内即可得出检测结果，检测下限均为102copies/μL，特异性强。用该方法与我国现行ASF 诊断技术标准中的方法对比，结果符合率为100%，从而为流行病学调查和现场检测提供了一种快速有效的检测方法。等温扩增方法具有操作简单、不需要昂贵的仪器设备、检测时间短、成本低、携带方便、灵敏度高等特点，可在等温条件下快速进行现场检测，因而为ASF防控提供了一种快速、直观的检测手段。

3 抗原检测

抗原检测是针对ASFV 的结构蛋白而建立的一种检测方法。该方法基于抗原抗体反应的基本原理，通过制备针对特定抗原表位的特异性抗体，在体外与病毒蛋白结合形成免疫复合物，从而对样品中ASFV 的结构蛋白进行检测，能够在发病早期和急性感染的窗口期检测到病毒。目前，抗原检测常用的方法有荧光抗体试验、夹心ELISA 抗原检测、高敏免疫荧光分析法、免疫层析试纸条等。

3.1 荧光抗体试验

ASFV 荧光抗体试验（f luorescent antibody test，FAT）可用于检测可疑猪组织样品中的病毒抗原。该方法被OIE 列为ASF 的辅助诊断方法，用于病毒分离和红细胞吸附试验的补充试验，能够区分ASFV 和其他病毒产生的细胞病变，及对“非红细胞吸附”ASFV 感染猪进行检测，但FAT 对荧光素标记的抗原特异性要求较高，非特异性的荧光素染色会造成假阳性结果。此外该方法对亚急性和慢性ASF 检出率低，仅为40%，但对早期急性ASF 病例检出率高[27]。该方法操作简单、快速、特异性强，但对人员要求较高，需要荧光显微镜以及必须在相应的生物安全三级及以上实验室进行，不适用于现场检测[27]。

3.2 夹心ELISA 抗原检测

夹心ELISA 是将特异性抗体作为固相包被在96 孔板中，再加入待检样品及酶标抗体孵育后显色，从而可对样品进行定性或定量的一种方法。我国现行的ASF 检测标准中是以辣根过氧化物酶标记的ASFV p30 蛋白单抗作包被抗体，对样品进行检测。而目前已有的商品试剂盒是西班牙INGEASA 公司的ASFV 抗原检测ELISA 试剂盒（DAS-ELISA）。Gallardo 等[28]用该试剂盒对277 份临床样本进行检测，与qPCR 相比较检测的敏感性为77.2%。张丽[27]制备了两株p54 蛋白单克隆抗体，命名为2E8 和HRP-6D8，基于这两种单克隆抗体建立了ASFV 双抗体夹心ELISA 检测方法。该方法与DAS-ELISA 试剂盒检测结果符合率为91.8%（134/146）。该方法操作较为简便、快速、成本较低，对仪器设备要求较低，较于抗体检测而言，可以更早地检出ASFV 感染，适用于对ASF的高通量检测和早期快速筛查，特别是对于早期急性型ASF 的诊断敏感性较高。而对于亚急性型和慢性型ASFV 感染，由于抗原-抗体复合物的存在，该方法的特异性及灵敏性稍低，易出现假阳性结果。因此，目前抗原ELISA 应与OIE 推荐的诊断技术结合使用，而较早开发一种快速、敏感、特异的ASFV 抗原ELISA 检测方法对ASF 防控极其重要。

3.3 高敏荧光免疫分析法

高敏荧光免疫分析法是一种将独特的镧系元素和免疫学反应结合起来，根据标准浓度曲线对待检样品浓度进行定量检测的新型检测技术。我国现行的ASF 检测标准是以镧系元素螯合物为荧光信号与抗原抗体免疫层析技术结合起来检测ASFV 抗原。Chen 等[29]利用Eu3+-螯合物标记制备的p30 单克隆抗体建立了一种检测ASFV 的时间分辨荧光免疫分析法（time-resolved f luorescence immunoassay，TRFIA），最低检测限为0.015 ng/mL，检测线性范围为0.24～500.00 ng/mL，室温下只需45 min 即可得到结果，与农业农村部批准使用的LAMP 同时检测125 份猪鼻液，两者结果一致。TRFIA 具有较高的敏感性、特异性和准确性，为养猪业快速筛查ASF 提供了一种新方法。

3.4 胶体金免疫层析试纸条

胶体金免疫层析试验（colloidal gold-based immunochromatographic assay，GICA）是将胶体金标记后的抗待测物抗体的标记物颗粒固定于玻璃纤维上，同时在硝酸纤维素膜上固定特异性抗体和抗抗体，分别作为检测带（test line）和质控带（control line），当试纸条插入检测样品时，抗原与抗体反应导致大量胶体金颗粒的聚集，进而呈现显色反应[30]。

为满足基层实验室或屠宰场、养殖场实验室对ASFV 的检测需求，王之莹[31]等针对ASFV p72蛋白基因设计一对特异性引物进行PCR 扩增，并与胶体金试纸条技术结合，建立了一种低成本检测ASFV 的侧流核酸测定试纸条（lateral f low nucleic acid assay，LFNAA）。该方法能够在2 h 内肉眼鉴定出结果，与中国动物疫病预防控制中心认可的ASFV 检测试剂盒的灵敏度相一致，均能达到103copies/uL。邬旭龙等[32]针对ASFV pK205R 蛋白制备了兔抗多克隆抗体，建立了ASFV 胶体金检测试纸条，其最佳标记量约为40 μg/mL，T 线捕获抗原的抗体标记最适质量浓度约为1.5 mg/mL，质控C 线标记最适质量浓度约为2 mg/mL，最小检测量为30～40 ng/mL。该方法操作简便，检测快速，反应条带清晰可见，且具有较高的检测特异性，为临床检测的推广和应用提供了科学依据。Zhang等[33]制备了两株针对ASFV 磷蛋白P30 的单克隆抗体，分别命名为3H7A7 和6H9A10，并基于这2株单克隆抗体建立了用于快速检测ASFV 的胶体金试纸条，检出限为2.16 ng，检测153 份临床现场样本（包括血清、血浆、组织和抗凝血处理过的血液），其结果与qPCR 的一致性为95.42%，为基层、现场快速筛选可疑感染猪供了一种方便、快捷、简单的检测技术，有利于在现场基层推广使用。

该方法使用方便，操作简单，应用范围广泛，整个检测过程不需要特定的仪器设备与试剂，且结果判定非常直观，因而对基层检测ASFV 非常适用。但是由于胶体金标记物的不稳定性和灵敏度不高，在判定时只能给出定性或者半定量的结果，因此更快研制出新型标记物的免疫层析试纸用于ASF 基层防控尤为重要。

4 小结

自2018 年ASF 传入我国已3 年有余。ASFV存活时间长、抵抗力强，基因组庞大、易变异，感染后抗体持续时间长，甚至可以终生携带抗体，截至目前仍无商业化疫苗可用，给我国养猪业造成了巨大经济损失。为了有效防控ASF，前期的快速检测/监测和猪场生物安全管理尤为重要。OIE 推荐的病原检测方法包括病毒分离、FAT以及PCR方法。病毒分离和红细胞吸附耗时较长，且对实验室要求较高，通常只有被参考实验室采用；对于病毒核酸检测，普通PCR 和qPCR 是OIE 推荐的首选诊断方法，其特异性和灵敏度均较高，但操作复杂、成本高；等温扩增技术操作简单、成本低、不需要特殊仪器、检测时间短、成本低、携带方便、灵敏度高，最适用于屠宰场、养殖场的现场检测，但因特异性不高，而灵敏度过高易出现假阳性，需要不断地更新和改进；微流控芯片法具有样品消耗少、检测速度快、操作简便、便于携带等优点，但因检测成本高和需要特定的设备未得到广泛使用；抗原检测技术FAT 对实验室要求较高，不适合现场检测；夹心ELISA 和胶体金免疫试纸条快速、操作简单、检测成本低，但敏感性和特异性还需改进。

综上所述，ASF 病原学检测技术虽很成熟，但各有优缺点，所以应根据实际情况结合使用。此外，近年来市面上有各种检测试剂盒，但这些试剂盒的敏感性、特异性和准确性，因缺乏大数据无法得到证实，需要按照标准对其进行评估和验证，以确保其特异性、灵敏度、精确度和稳定性，从而为基层正确选择试剂盒提供依据。