刺五加苷E对野百合碱诱导肺动脉高压模型大鼠的治疗作用

田京辉，郭姗姗，陈静静，徐炳欣，赵亮

(1.河南科技大学附属许昌市中心医院药学部，许昌 461000；2.许昌市分子医学重点实验室，许昌 461000；3.第二军医大学药学院生化药学教研室，上海 200433)

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)指肺动脉压力升高超过一定界值的一种血流动力学和病理生理状态，预后恶劣，严重威胁人类健康[1-2]。近年来出现的靶向治疗药物尽管改善患者的预后，但其短期疗效好，长期疗效欠佳，仅仅起到对“症”治疗的效果，远不能满足临床需求[3-4]。因此，寻找新颖有效的PAH治疗药物具有重要意义。刺五加苷E是从传统补“气”中药刺五加中分离和鉴定出的一种酚苷类化合物，是五加科植物刺五加的主要活性成分之一，具有固本强体、抗衰老、抗疲劳、提高机体适应能力、改善血液循环等多种药理学作用[5-8]。刺五加苷E能否对PAH起到防治作用，以及其潜在的作用机制尚有待研究。笔者在本研究旨在观察和探讨刺五加苷E对野百合碱(monocrotaline，MCT)诱导PAH大鼠的治疗作用及其机制，以期为PAH的防治提供新颖的候选化合物。

1 材料与方法

1.1实验动物 雄性无特定病原体(SPF)级Sprague-Dawley(SD)大鼠48只，体质量180～220 g，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2019-0010。SD大鼠饲养于25 ℃恒温，相对湿度50%，常规饲料与自由饮水，以及光照/黑暗12 h交替循环的屏障环境中。

1.2试剂 刺五加苷E(中国食品药品检定研究院，批号：111713-201804)；MCT[Sigma-aldrich(上海)贸易有限公司，批号：C2401]；细胞核染料4’，6-diamidino-2-phenylindole(DAPI，德国Partec Flow Cytometry Technology公司，批号：05-5005)；RIPA裂解液(Cell Signaling Technology公司，批号：9806)；超敏型电化学发光显色(ECL)试剂盒(赛默飞世尔科技公司，批号：32134)；SDS、Tris-base、甘氨酸、丙烯酰胺、聚山梨酯-20等试剂购自美国Amresco公司。

1.3仪器 蛋白电泳仪、转膜仪及Quantity One 1-D分析软件购自Bio-Rad公司；荧光显微系统Nikon ECLIPSE Ti购自尼康公司；HistoCore Arcadia 包埋机(EG1150H)、石蜡切片机(RM2235)购自上海莱卡仪器有限公司；PowerLab多导生理记录仪购自埃德仪器国际贸易(上海)有限公司。

1.4动物分组及处理 48只SD大鼠预适应饲养1周后，按数字随机分为2组，每组24只。其中模型组给予颈背部皮下注射MCT(60 mg·kg-1)造模，对照组同步给予等体积0.9%氯化钠溶液。诱导后1周，模型组和对照组分别按数字随机取12只进行刺五加苷E干预(10 mg·kg-1，腹腔注射，qd)，分别为模型+刺五加苷E组和对照+刺五加苷E组，剩余12只同步给予等体积0.9%氯化钠溶液，连续给药2周后进行右心导管等评估实验。

1.5右心导管实验 给药2周后采用右心导管法测定各组大鼠血流动力学指标。大鼠称定质量后腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉。将大鼠固定于手术台，气管插管后，连接肺动脉压力测量仪器，暴露出右侧颈外静脉。插入PE50导管，将导管缓慢推送入心腔，向左下转动导管，观察、记录波形，分析各组动物平均肺动脉压(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)、右心室收缩压(right ventricle systolic pressure，RVSP)等血流动力学指标。

1.6右心肥厚指数评估 处死大鼠取出完整心脏，预冷0.9%氯化钠溶液冲洗后汲干水分，分离并称取右心室(right ventricle，RV)、左心室(left ventricle，LV)及室间隔(septum，S)质量，采用下述公式计算并比较各组大鼠右心肥厚指数(right ventricle hypertrophy index，RVHI)[9]，即Fulton’s指数，RVHI=RV/(LV+S)。

1.7组织病理学实验 取各组大鼠肺组织，置于4%多聚甲醛中固定24 h后，进行脱水和石蜡包埋。使用手动转轮石蜡切片机进行连续切片(厚度为4 μm)，将组织切片置于烤片机上烘烤，随后进行脱蜡、苏木精染色、1%盐酸乙醇分化、返蓝、伊红染色、脱水、透明、中性树胶封片等[10]，显微镜下观察肺组织血管形态。

1.8抗血浆血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)和抗α-平滑肌抗体(α-SMA)免疫荧光双染法检测肺小动脉肌化水平 将组织切片用EDTA高压抗原修复后，依次进行磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤和封闭打孔。随后，与一抗(抗vWF兔多克隆抗体，1：1500稀释；抗α-SMA小鼠多克隆抗体，1：1000稀释)4 ℃孵育过夜，37 ℃复温。PBS洗涤后，将组织切片与二抗[Fluorescein-Conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)和Goat anti-Mouse IgG/Alexa Fluor®594，均1：500稀释]在避光条件下孵育2 h，洗涤，DAPI染核封片，保存于4 ℃干燥、避光环境下，于显微镜下观察摄像。

1.9Western blotting实验 用RIPA(含0.1 mmol·L-1的PMSF)裂解液提取大鼠肺组织总蛋白，取样10 μL(总蛋白约4 mg)进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分析，首先用80 V电压电泳，当溴酚蓝泳动至分离胶，调整电压为120 V继续电泳至溴酚蓝达分离胶底部。转膜，在冰浴中用200 mA电流持续作用2 h，将蛋白从PAGE胶上转移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜；将膜浸泡于5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)中，室温下封闭2 h。将磷酸化信号通路抗体(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K；RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，Akt)用5% BSA稀释至工作浓度，与封闭后PVDF 膜于4 ℃孵育过夜。洗膜，将辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)结合的二抗用5% BSA稀释至工作浓度，与PVDF膜于室温下作用1 h；再次洗膜，在PVDF膜上滴加适量的ECL发光试剂，室温下作用1 min，用GelDocTM+系统进行曝光。用Quantity One 1-D分析软件对条带进行灰度扫描，并对其进行定量分析。

2 结果

2.1刺五加苷E对MCT诱导SD大鼠肺血流动力学影响 MCT诱导后3周，模型组大鼠RVSP(44.95±3.59) mmHg，mPAP(42.20±3.18) mmHg，均较对照组[(19.09±3.89)和(18.07±2.08) mmHg]显著升高(均P<0.01)，提示经过MCT的诱导，SD大鼠已出现明确的PAH表型。模型+刺五加苷E组大鼠RVSP和mPAP均显著下降，分别为(33.18±4.85)和(31.77±5.41) mmHg，均差异有统计学意义(均P<0.01)，说明刺五加苷E能够显著降低SD大鼠肺血管压力。对照+刺五加苷E组RVSP和mPAP分别(18.00±3.59)和(17.94±2.34) mmHg，与对照组比较未见明显变化，说明刺五加苷E对于正常大鼠的血流动力学并不产生明显的影响。

2.2刺五加苷E对MCT诱导SD大鼠RVHI的影响 模型组大鼠RVHI(0.41±0.07)较对照组(0.23±0.03)显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)，提示PAH大鼠出现明显的右心肥厚现象；模型+刺五加苷E组RVHI显著下降至(0.29±0.03)(P<0.01)，说明刺五加苷E能够显著改善PAH大鼠右心肥厚。对照+刺五加苷E组RVHI为(0.22±0.03)，与对照组比较未见明显变化，说明刺五加苷E对于正常大鼠的右心并不产生明显的影响。

2.3刺五加苷E对MCT诱导大鼠肺动脉中膜厚度影响 光镜下观察HE染色结果见图1。对照组大鼠肺组织形态结构正常，肺小动脉(直径<100 μm)血管中层约占血管总横截面积(22.32±4.40)%，而模型组血管中层明显增厚，其占比高达(47.67±2.88)%(P<0.01)，模型+刺五加苷E组肺小动脉血管中层约占血管总横截面的(34.88±3.24)%，较模型组显著降低(P<0.01)，提示刺五加苷E能够显著改善肺小动脉中膜肌层病理性增生，对照+刺五加苷E组占比为(23.17±3.56)%，无明显变化。

A.对照组；B.对照+刺五加苷E组；C.模型组；D模型+刺五加苷E组；①与对照组比较，P<0.01；②与模型组比较，P<0.01。图1 4组大鼠肺动脉中膜病理图(HE)A.Control group；B.Control + eleutheroside E group；C.Model group；D.Model + eleutheroside E group；①Compared with control group，P<0.01；②compared with model group，P<0.01.Fig.1 Pathological images of membrane in pulmonary artery of four groups of rats (HE)

2.4刺五加苷E对MCT诱导大鼠肺小动脉肌化影响 荧光显微镜下观察肺小血管肌化程度见图2。对照组完全肌化肺小血管比例为(10±2.83)%，模型组完全肌化肺小血管比例高达(53.80±6.76)%(P<0.01)，模型+刺五加苷E组完全肌化肺小血管比例降至(38.8±3.42)%，较模型组肺小血管完全肌化比例显著下降(P<0.01)，对照+刺五加苷E组完全肌化肺小血管比例为(11.5±3.79)%。对于非肌化肺小血管比例而言，模型+刺五加苷E组(32.2±3.90) %较模型组(15.8±4.92)%显著升高(P<0.01)，提示刺五加苷E能够改善MCT诱导的肺血管病理性重构。这一结果与上述H&E染色结果相吻合，进一步证实刺五加苷E对MCT诱导PAH大鼠的治疗作用。

A.对照组；B.对照+刺五加苷E组；C.模型组；D模型+刺五加苷E组；红色指示平滑肌细胞标志物α-SMA；绿色指示内皮细胞标志物vWF；蓝色指示细胞核标志DAPI； NM：未肌化； PM：部分肌化； FM：完全肌化；①与对照组比较，P<0.01；②与模型组比较，P<0.01。图2 刺五加苷E对MCT诱导SD大鼠肺小动脉肌化的影响A.Control group；B.Control + eleutheroside E group；C.Model group；D.Model + eleutheroside E group；Red indicates the smooth muscle cell marker α-SMA；Green indicates the endothelial cell marker vWF；Blue indicates the cell nucleus marker DAPI；NM: non-muscularized；PM: partial muscularized；FM: full muscularized；① Compared with the control group，P<0.01；② Compared with the model group，P<0.01.Fig.2 Effects of eleutheroside E on MCT-induced pulmonary arteriole muscularization in SD rats

2.5刺五加苷E抑制PI3K/Akt信号通路激活 MCT诱导3周后，与对照组比较，模型组肺组织PI3K和Akt磷酸化明显增加(均P<0.01)，刺五加苷E治疗后磷酸化PI3K蛋白表达下调至模型组74%(P<0.05)(图3)。同时，观察到刺五加苷E能够显著减少MCT诱导后肺组织Akt的磷酸化(图3)，干预后仅为模型组54%(P<0.01)，提示刺五加苷E可能通过抑制PI3K和Akt通路逆转PAH表型。

A.对照组；B.对照+刺五加苷E组；C.模型组；D模型+刺五加苷E组；①与对照组比较，P<0.01；②与模型组比较，P<0.05；③与模型组比较，P<0.01。图3 刺五加苷E对MCT诱导SD大鼠肺组织PI3K/Akt信号通路影响A.Control group；B.Control + eleutheroside E group；C.Model group；D.Model + eleutheroside E group；①Compared with control group，P<0.01；②compared with model group，P<0.05；③compared with model group，P<0.01.Fig.3 Effects of eleutheroside E on PI3K/Akt signaling pathway in lung tissues of SD rats induced by MCT

3 讨论

近年来，已有多种靶向药物陆续进入临床，但PAH患者的长期预后依然不容乐观[11]。随着中医中药事业的蓬勃发展，多种中药及提取成分已被证实有益于PAH的治疗[12]。刺五加苷E作为刺五加中最具药理活性的主要成分之一，近年来受到越来越多的关注。然而，既往的研究主要集中在其对免疫性疾病、脑血管痉挛、糖尿病等疾病的治疗，而对刺五加苷E防治PAH的研究，缺乏系统的功能评价。在本研究中，笔者通过建立MCT诱导的PAH大鼠模型，并进行刺五加苷E干预；通过血流动力学、右心肥厚指数、肺血管重构与肌化水平的检测，评估了刺五加苷E对MCT诱导PAH大鼠疾病进程的影响，首次发现刺五加苷E对PAH的治疗作用。

通常情况下，为了确证候选药物或靶点的功能，仅仅采用一种动物模型是不充分的。目前PAH基础研究领域，常用的动物模型包括：MCT-PAH大鼠模型、低氧-PAH大鼠模型和低氧+sugen5416-PAH大鼠模型等。低氧+sugen5416-PAH大鼠模型周期较长、操作相对繁琐，但能够很好模拟临床PAH患者肺组织丛样病变特征。在笔者当前的研究中，由于缺乏合适的低氧舱等设备，难以给予大鼠合适的低氧诱导环境，因此仅仅使用MCT诱导的方式进行模型的建立，这是本研究的一个局限性和不足。在未来的研究中，刺五加苷E对PAH的治疗作用还应进一步通过低氧、低氧+sugen5416等经典模型进行验证。

为了探索刺五加苷E发挥PAH治疗作用的分子机制，检测了肺组织中信号转导通路的变化。本研究结果发现，刺五加苷E显著抑制PAH大鼠肺组织PI3K和Akt蛋白的磷酸化水平。PI3K/Akt被认为是JAK下游的信号分子，PI3K磷酸化以后可迅速激活其下游的信号分子AKT，并使其活化。活化后的PI3K/Akt可进一步激活其下游mTOR(mammalian target of rapamycin)，并使其转导入核，从而调节细胞的增殖、凋亡等生理病理学作用[13-14]。本研究结果进一步证实PI3K/Akt通路在介导PAH发生发展中具有重要作用[15]，同时，也提示抑制PI3K/Akt通路可能是刺五加苷E发挥PAH治疗作用的潜在机制。诚然，当前这些结果还仅仅是一个线索和提示，为了确证PI3K/Akt通路正是刺五加苷E介导的调控途径，还应采用PI3K/Akt抑制剂如Capivasertib (AZD5363)、或其特异性干扰RNA等材料对该通路进行干预，以解析刺五加苷E明确的作用机制。

综上所述，本研究首次揭示传统中药提取物刺五加苷E可能通过调节PI3K/Akt途径对PAH起到治疗作用，这将为开发PAH的治疗策略提供一个新颖的选项。