滇龙胆草抑制MAPK信号通路对小鼠肺纤维化的影响*

朱振东，皮娜，何琴，钟燕，张旋

(1.云南省第三人民医院/大理大学第二附属医院老年病科，昆明 650011；2.昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，昆明 650500)

肺纤维化是由多种原因引起，以肺泡上皮损伤、免疫细胞浸润、成纤维细胞异常增殖分化、细胞外基质过度沉积为特征的一种致命性疾病[1]。肺纤维化患者平均生存时间不到5年[2]。目前，美国食品药品管理局(FDA)已批准两种治疗肺纤维化的药物尼达尼布和吡非尼酮，虽然能在一定程度上改善肺纤维化，但腹泻、恶心、鼻咽炎、皮肤相关症状、肝功能损害等不良反应限制了其临床应用[3]。而且这两种药物价格昂贵，普通患者难以承受。因此，研发高效、低毒、经济的抗肺纤维化新药十分必要。

滇龙胆草(GentianarigescensFranch.ex Hemsl.)为龙胆科龙胆属植物，也被称为坚龙胆、苦胆草、小秦艽等，为云南道地中药材，广泛分布在世界各地，主产于云南，在四川、贵州、广西、湖南等地也有分布[4]。滇龙胆草主要以根及根茎入药，味苦、性寒，归肝、胆经，作为草药已经有很长的历史。目前滇龙胆草已被《中华人民共和国药典》2020年版收录，作为传统中药材龙胆的重要基源植物。滇龙胆草(坚龙胆)与《中华人民共和国药典》收录的其他3中龙胆基源植物条叶龙胆(GentianamanshuricaKitag)、龙胆(GentianascabraBge)、三花龙胆(GentianatrifloraPall)的化学成分基本相同，仅在某些成分，如龙胆苦苷含量上有差异，其功效也相同，均为清热燥湿、泻肝胆火。研究表明，从龙胆属植物中分离出的主要生物活性成分为环烯醚萜、黄酮类化合物，具有广泛的药理活性，包括保护肝脏、保护胃肠道、保护心血管、抗炎、免疫调节等，此外，源于该植物的天然产物没有明显的动物毒性、细胞毒性和基因毒性[5]。研究发现，源于龙胆属植物的原料药及环烯醚萜类化合物能够明显改善大鼠和小鼠肝纤维化程度[6-7]，源于龙胆属植物的环烯醚萜苷类化合物龙胆苦苷能够明显改善肺纤维化小鼠肺部炎症和纤维化病变[8]。滇龙胆草中含有龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、苦龙胆酯苷等成分，因此推测滇龙胆草对肺纤维化也有一定的改善作用。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信号通路既参与肺纤维化早期炎症反应，又与转化生长因子-β(TGF-β)信号通路发生交互作用，作为TGF-β 信号通路中的非Smad依赖型通路，参与肺纤维化形成中多个环节。研究发现，龙胆属植物秦艽提取物可通过抑制MAPK信号通路减轻炎症反应，从而减轻酒精性肝疾病[9]。因此，笔者在本研究在博莱霉素制备小鼠肺纤维化模型上观察滇龙胆草的抗肺纤维化作用及其对MAPK信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 无特定病原体(SPF)级雄性昆明种小鼠60只，5～7周龄，体质量(20±2) g，由昆明医科大学实验动物学部提供，实验动物生产许可证号：SCXK(滇)2020-0004。小鼠饲养条件：12 h明暗交替、温度为18～26 ℃，日温差≤3 ℃，相对湿度40%～70%，适应性喂养7 d后开始实验。

1.2药物与试剂 滇龙胆草购自昆明市螺蛳湾中药材市场，并经昆明医科大学药学院陆露教授鉴定为滇龙胆，样本编号：20200625；吡非尼酮(批号：J1001A)购自大连美仑生物技术有限公司；盐酸博莱霉素(BLM，批号：19012311)购自海正辉瑞制药有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型，批号：090119191205)，SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒(批号：071820200727)购于碧云天生物技术公司；Masson三色染色试剂盒(批号：1911278004)购自福州迈新生物技术有限公司；p38MAPK抗体(货号：8)，JNK抗体(货号：7)，Erk1/2抗体(货号：24)购自美国CST公司；白细胞介素(IL)-13 抗体(批号：GR40065-10)、Collagen I 抗体(批号：GR3334458-1)购自美国abcam公司；GAPDH 抗体(批号：10494-1-AP)，HRP-偶联Goat Anti-Rabbit IgG(批号：20000243)购自美国 Proteintech公司；Bio-rad Clarity Western电致化学发光(ECL)底物(批号：170-5060)，购自美国Bio-rad公司；蛋白Marker(相对分子质量11 000～180 000，批号：PL00001)购自美国 Proteintech公司。

1.3药物配制、动物分组与处理

1.3.1药物配制 将滇龙胆草粉末过四号筛后，用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制成0.5%，1%和2%滇龙胆草混悬液，将吡非尼酮用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制成0.5%的溶液。

1.3.2动物分组与处理 小鼠适应性饲养7 d，开始实验。小鼠按体质量采用随机数字表法分为6组，正常对照组，模型对照组，吡非尼酮组，滇龙胆草小、中、大剂量组，每组10只。正常对照组一次性气管内滴注无菌0.9%氯化钠溶液，其余组一次性气管内滴注博莱霉素5 mg·kg-1制备肺纤维化小鼠模型[8]。造模当天，正常对照组和模型对照组小鼠灌胃给予相应体积0.5%羧甲基纤维素钠溶液，吡非尼酮组灌胃给予50 mg·kg-1吡非尼酮，滇龙胆草小、中、大剂量组分别灌胃给予50，100，200 mg·kg-1滇龙胆草0.5%羧甲基纤维素钠溶液，各组给药体积为10 mL·kg-1，每天1次，连续28 d，分别在给药1，7，14，21，28 d称量小鼠体质量。

1.4样本收集 给药第28天，称取小鼠体质量，麻醉处死，收集肺组织标本，将左肺置于10%中性甲醛固定液中固定，用于肺组织病理学观察进行苏木精-伊红(HE)染色、Masson染色，其余肺组织置于液氮中速冻，后置于-80 ℃冰箱中冻存用于Western blotting检测。

1.5肺组织病理学观察 取出10%甲醛固定液固定好肺组织，脱水，透明，石蜡包埋，切片(厚度约5 μm)，烤片，脱蜡，透明，脱水，进行HE染色和Masson染色，中性树胶封片，晾干，光镜下观察肺组织病理学变化。参照文献[10]方法对肺泡炎进行评分，参照文献[11]方法对肺间质纤维化程度进行评分。

1.6Western blotting 检测MAPK信号通路相关蛋白表达 取肺组织充分研磨，加入RIPA裂解液裂解，离心，收集上清液，BCA 试剂盒测定蛋白浓度，加入Loading buffer，沸水煮10 min使蛋白变性。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白组分，湿转法将蛋白转移到聚偏氟乙烯(Polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，用10%脱脂奶粉进行封闭，TBST洗涤。加入一抗p38 MAPK(1：1000)、JNK(1：1000)、Erk1/2(1：1000)、IL-13(1：1000)、Collagen I(1：1000)、GAPDH(1：2500)4 ℃孵育过夜。TBST洗涤。加入山羊抗兔 IgG-HRP 二抗(1：5000)室温孵育2 h，TBST洗涤，将条带置于成像仪中，滴入ECL显影液进行曝光。采用Image J软件进行灰度值分析。以GAPDH为内参蛋白，以检测蛋白与GAPDH蛋白的灰度值之比定量分析蛋白相对表达水平。

2 结果

2.1小鼠生长曲线和28 d平均体质量 从生长曲线结果可知，正常对照组小鼠体质量增长最快，模型对照组体质量增长最慢。从小鼠28 d平均体质量可知，与正常对照组比较，模型对照组体质量最低(P<0.01)，与模型对照组比较，各药物治疗组体质量均显著增高(P<0.01)。见图1。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.吡非尼酮组；D.滇龙胆草小剂量组；E.滇龙胆草中剂量组；F.滇龙胆草大剂量组；①与正常对照组比较，t=4.75， P<0.01；②与模型对照组比较，t=-1.07～3.25，P<0.01。图1 6组小鼠生长曲线和28 d 平均体质量A.normal control group；B.model control group；C.pirfenidone group ；D.low-dose of Gentiana rigescens Franch group；E.medium-dose of Gentiana rigescens Franch group；F.high-dose of Gentiana rigescens Franch group；①Compared with normal control group，t=4.75，P<0.01；②Compared with model control group，t=-1.07-3.25，P<0.01.Fig.1 The growth curve and 28-day average body mass of six groups of

2.2滇龙胆草对小鼠肺组织病理学及胶原沉积的影响 HE 染色结果显示，正常对照组肺组织结构正常，肺泡腔内无明显的炎性细胞浸润，肺泡间隔纤细，分布均匀且结构稍完整。与正常对照组比较，模型对照组肺泡壁增厚，肺泡腔内及肺间质有大量的炎性细胞浸润，部分肺泡断裂，肺泡结构完整性被破坏，病理学评分差异有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组比较，吡非尼酮组与滇龙胆草各剂量组肺组织破坏程度有较大改善，肺间隔变薄，肺泡腔及肺间质中炎性细胞浸润较模型对照组明显减轻，肺泡结构完整，病理学评分差异有统计学意义(P<0.01)。见图2，图3。

Masson 染色结果显示，正常对照组小鼠肺组织中仅出现少量染色反应，而模型对照组小鼠肺组织中可见大量蓝色的胶原纤维，胶原沉积严重。与正常对照组比较，模型对照组胶原纤维明显增多(P<0.01)；与模型对照组比较，吡非尼酮组与滇龙胆草各剂量组小鼠肺组织病变程度均减轻，胶原沉积显著减少(P<0.05)。见图2，图3。

图2 6组小鼠病理学形态(×200)Fig.2 Pathological morphology of lung tissues in six groups of mice(×200)

A.正常对照组；B.模型对照组；C.吡非尼酮组；D.滇龙胆草小剂量组；E.滇龙胆草中剂量组；F.滇龙胆草大剂量组；①与正常对照组比较，t=4.13～5.31， P<0.01；②与模型对照组比较，t=1.51～1.84，P<0.05；③与模型对照组比较，t=2.91～3.18，P<0.01。图3 6组肺组织病理形态学评分Fig 3 The histopathological score of lung tissues in six groups of A.normal control group；B.model control group；C.pirfenidone group ；D.low-dose Gentiana rigescens Franch group；E.medium-dose Gentiana rigescens Franch group；F.high-dose Gentiana rigescens Franch group；①Compared with normal control group， t=4.13-5.31，P<0.01；②Compared with model control group， t=1.51-1.84，P<0.05；③Compared with model control group， t=2.91-3.18，P<0.01.

2.3滇龙胆草对小鼠肺组织中MAPK信号通路蛋白表达的影响 与正常对照组比较，模型对照组小鼠肺组织p38、Erk1/2、JNK、IL-13、Collagen I蛋白表达明显上调，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型对照组比较，滇龙胆草各剂量组小鼠肺组织p38、Erk1/2、JNK、IL-13、Collagen I蛋白表达明显下调，差异有统计学意义(P<0.05)，滇龙胆草大剂量组蛋白表达下调效果与阳性药物吡非尼酮组相当。结果表明，滇龙胆草可显著降低肺纤维化小鼠肺组织中p38、Erk1/2、JNK、IL-13、Collagen I蛋白表达。见图4。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.吡非尼酮组；D.滇龙胆草小剂量组；E.滇龙胆草中剂量组；F.滇龙胆草大剂量组；①与正常对照组比较，t=4.41～7.12，P<0.01；②与模型对照组比较，t=2.16～2.42，P<0.05；③与模型对照组比较，t=3.15～5.60，P<0.01。图4 6 组小鼠肺组织中p38、ERK1/2、JNK、IL-13、Collagen I蛋白表达A.normal control group；B.model control group；C.pirfenidone group ；D.low-dose of Gentiana rigescens Franch group；E.medium-dose of Gentiana rigescens Franch group；F.high-dose of Gentiana rigescens Franch group；①Compared with normal control group，t=4.41-7.12，P<0.01；②Compared with model control group，t=2.16-2.42，P<0.05；③Compared with model control group，t=3.15-5.60，P<0.01.Fig.4 Protein expression of p38， Erk1/2， JNK， IL-13 and Collagen I in lung tissues of six groups of

3 讨论

肺纤维化的病理特征是肺组织反复损伤修复，造成肺泡持续损伤、成纤维细胞增生，最终导致肺间质大量细胞外基质沉积，是许多肺部疾病的共同结局。肺纤维化早期以肺部炎症为主，随后进入慢性炎症和组织修复期，最终因成纤维细胞过度增殖、肺组织异常修复，导致大量胶原纤维沉积在肺间质形成肺纤维化[12]。本研究发现，不同剂量滇龙胆草能够明显减轻肺纤维化小鼠肺组织炎症细胞浸润，抑制肺组织胶原纤维沉积，下调 Collagen I表达，明显降低肺纤维化小鼠肺泡炎、肺纤维化评分，提示滇龙胆草可减轻肺组织炎症和间质胶原纤维，从而减轻肺纤维化小鼠的纤维化程度。

体质量减轻是肺纤维化的常见并发症，而且体质量减轻与肺纤维化患者的生存率呈负相关[13]。从小鼠28 d生长曲线可见，正常对照组小鼠体质量增长最快，模型对照组小鼠体质量增长最慢，提示肺纤维化对小鼠体质量增长有一定影响，不同剂量滇龙胆草组小鼠体质量增长明显比模型对照组快，间接表明滇龙胆草能够减轻肺纤维化。

MAPKs是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。研究证实，MAPKs信号转导通路存在于大多数细胞内，在将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，并引起细胞生物学效应(如细胞增殖、分化、转化及凋亡等)的过程中具有至关重要的作用。现已发现哺乳动物主要有3条MAPK信号通路：Erk、 JNK和p38 MAPK信号通路。MAPK信号通路与肺纤维化的发生发展密切相关，在肺纤维化发病过程中发挥了重要作用[14]。研究发现，p38MAPK信号通路激活后可进一步激活下游NF-κB信号通路，促进巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞释放炎症细胞因子TNF-α、IL-1β和黏附分子，级联放大肺纤维化早期炎症反应，还可促进肺泡上皮细胞发生上皮-间质转化、促进成纤维细胞增殖分化，在肺纤维化形成中起着重要作用[15]。Erk信号通路的激活与许多致纤维化因子如 TGF-β、PDGF、CTGF有关，参与肺纤维化形成中成纤维细胞增殖和细胞外基质的沉积[16]。JNK信号通路也参与了肺纤维化的形成，主要是通过上调促凋亡基因Bax、Fasl、p53表达从而促进肺泡上皮细胞凋亡[17]。蛋白表达研究显示，与正常对照组比较，模型对照组小鼠肺组织p38、JNK和Erk1/2蛋白表达明显升高；与模型对照组相比，滇龙胆草各剂量组小鼠肺组织p38、JNK和Erk1/2蛋白表达明显下调，呈浓度依赖效应，提示滇龙胆草抗肺纤维化的作用机制与抑制p38/JNK/Erk MAPK信号通路有关。

IL-13是一种Th2细胞生成的促纤维化细胞因子，具有抗炎、促纤维化、免疫调节的作用，能够抑制单核细胞、巨噬细胞分泌炎性细胞因子，促使B细胞分泌抗体。研究发现，IL-13 与肺纤维化的发病关系密切，作为Th2细胞因子，IL-13 可促进肺巨噬细胞由向M2型极化，产生促纤维化递质，促进成纤维细胞增殖分化[18]。本研究发现，模型对照组小鼠IL-13蛋白表达水平显著高于正常对照组，滇龙胆草各剂量组IL-13蛋白表达水平显著低于模型对照组，提示滇龙胆草能够下调肺纤维化时肺组织IL-13蛋白表达。

综上所述，滇龙胆草能够减轻博来霉素诱导的小鼠肺纤维化，其作用机制与抑制MAPK信号通路和下调IL-13蛋白表达有关。本研究可为滇龙胆草防治肺纤维化提供一定的实验依据，为肺纤维化的治疗提供新的治疗策略，但由于肺纤维化发病机制复杂，滇龙胆草抗肺纤维化的确切作用机制有待进一步研究。