天然环肽auyuittuqamide A 的全合成研究

耿晨晨，汪甜甜，李 翔，王小彦，姜云云（1.安徽医科大学无锡临床学院,江苏 无锡 14044；.海军军医大学药学系天然药物化学教研室,上海 004；.重庆市妇幼保健院,重庆 400010；4.中国人民解放军联勤保障部队第九〇四医院，江苏 无锡 14044）

环肽主要源于植物、真菌，以及海洋天然产物和绝大多数生物有机体中[1]。环肽是具有特殊的生物活性和较强的药理活性的一类化合物[2-3]。而且大多数环肽结构比直链肽更加稳定，且脂溶性高、穿膜性强、体内半衰期长等优点[4-5]，从而使环肽在抗肿瘤、抗病毒、天然领域中起着重要的作用[6-9]。

Auyuittuqamide A 是从极地海洋天然产物微孢子菌属（RKAG186）中分离得到的一种环肽化合物，它是由10 个氨基酸残基组成。Russell 等[10]从Sesquicillium microsporum中分离得到四个环十肽auyuittuqamide A-D。该类肽有一定的天然活性和对人体低毒性[11-12]。auyuittuqamide A 经过核磁共振光谱法和串联质谱法证明了这类化合物的结构。用Marfey 法[13]确定了氨基酸的绝对结构。然而，天然产物中分离提取的auyuittuqamide A 的含量很低，很难推进构效关系和下一步的研究与应用。因此，采用固相合成法合成环十肽具有成本低、时间短、操作简单等优点[14-16]。

本文用2–氯三苯甲基氯（CTC）树脂为固相载体，通过HOBT/DIC 为缩合体系，依次缩合氨基酸，完成全保护直链肽的合成。再以PyBOP/HOBT/DIPEA 为缩合体系，在DCM 溶液中液相环合[17-19]，随后利用TFA 进行保护基的脱除，进而得到环十肽auyuittuqamide A（图1）。

图1 Auyuittuqamide A 的结构式

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

Fmoc-L–亮氨酸（Fmoc-Leu-OH）、Fmoc–甘氨酸（Fmoc-Gly-OH）、Fmoc-L–缬氨酸（Fmoc-Val-OH）、Fmoc-O–叔丁基–L–丝氨酸（Fmoc-Ser(tBu)-OH）、Fmoc-L–异亮氨酸（Fmoc-Ile-OH）、N-（9–芴甲氧羰酰基）-N–甲基–L–苯丙氨酸（Fmoc-N-Me-LPhe-OH）、Fmoc-N–甲基–L–缬氨酸（Fmoc-N-Me-LVal-OH）、N-Fmoc-N–甲基–O–叔丁基–L–苏氨酸（Fmoc-N-Me-Thr(tBu)-OH）[希施生物科技（上海）有限公司]；2–氯三苯甲基氯（CTC）树脂(上海吉尔生化有限公司)；N,N–二异丙基乙胺（DIPEA）、六氟磷酸苯并三唑–1–基–氧基三吡咯烷基磷（PyBOP）、1–羟基苯并三氮唑（HOBT）、1,3–二异丙基碳二亚胺（DIC）、三氟乙醇（TFE）、三氟乙酸（TFA）购自北京百灵威科技有限公司；N,N–二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM）(国药集团化学试剂有限公司)；乙腈为色谱纯。

CHA-S 气浴恒温振荡器（江苏金坛国胜实验仪器厂）；SK7200BT 超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；LD5-2A 低速离心机（北京京立离心机有限公司）；低温恒温反应浴（槽）、SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（上海东玺制冷仪器设备有限公司）；WSZ-50A 轨道式振荡器（上海－恒科技有限公司）；Waters2695/E2695 高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；LC-1 型反向制备液相色谱仪（北京创新恒通科技有限公司）；6 538 UHD Accurate Mass QTOF LC/MS 质谱仪（美国安捷伦公司）。

1.2 实验方法

按图2 路线，固相合成天然环肽auyuittuqamide A。

图2 Auyuittuqamide A 的合成路线

1.2.1 直链肽固相合成

用称量纸称取2–氯三苯甲基氯（CTC）树脂1 g（载样量为0.45 mmol/g）于多肽固相合成反应管中，加入DCM（10 ml）和DMF（10 ml）溶胀树脂，20 min后抽干。用DMF 和DCM 冲洗5 遍，加Fmoc-Gly-OH（600 mg，2 mmol）和DIPEA（666 μl）的DMF 溶液入反应管中，反应管固定于CHA-S 气浴恒温振荡器中常温震荡4 h。再用DCM 和DMF 各洗涤5 遍，抽干之后再加入20%哌啶的DMF 溶液（10 ml），重复2 遍，每一遍10 min，从而脱去氨基酸上的Fmoc 保护基，再依次使用DMF 和DCM 各洗涤5 遍。之后将已经配置好的Fmoc–氨基酸–OH（2 mmol，5 倍当量），HOBT（2 mmol，5 倍当量），DIC（2 mmol，5 倍当量）的DMF 溶液加入到反应管中，反应管固定于CHA-S 气浴恒温振荡器中常温震荡2 h，反应完成之后，再使用DMF 和DCM 冲洗5 遍。重复上述步骤，依次偶联氨基酸Fmoc-NMe-L-Val-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-N-Me-L-Phe-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-N-Me-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH。

1.2.2 直链肽的切割与纯化

所有氨基酸完成偶联之后，获得直链肽–树脂复合物，使用无水乙醚将其挥干，加入TFE/DCM（1∶4，V/V）混合溶液10 ml，放置在轨道式振荡器，常温震荡4 h。过滤并收集滤液，滤液用旋转蒸发仪蒸干，获得直链肽粗品，粗品用制备型RPHPLC 进行纯化，再使用冻干机将其干燥，获得纯品直链肽。

1.2.3 直链肽的环合

在0 ℃的条件下将直链肽溶于50 ml 的DCM溶液缓慢滴加入HOBT（3 eq）、PyBOP（5 eq）、DIPEA（10 eq）溶于DCM 50 ml 中，滴加完成之后，于常温搅拌反应过夜。反应结束后，使用旋转蒸发仪蒸干反应溶剂，获得目标粗品，再将粗品用制备型RP-HPLC 纯化，再使用冻干机将其干燥，获得纯品环肽。

1.2.4 环肽侧链保护基的脱除与纯化

先配置脱除侧链保护基溶液12 ml（TFA/DCM=1/3），将溶液加入到环肽冻干后的纯品中，固定于轨道式振荡器，常温震荡反应4 h。

1.2.5 纯化条件

色谱条件：Ryoung C18色谱柱（20mm×250 mm，10 μm）；流动相A：水+0.1%TFA，流动相B：乙腈+0.1%TFA，梯度洗脱：(0～5 min，40% B；5～60 min，40%～70% B)；流速：20ml/min;紫外检测波长214 nm。

2 结果与讨论

2.1 Auyuittuqamide A 直链肽的HPLC 和高分辨质谱表征

本步是将直链肽从树脂上切割，得到油状物粗品360 mg，再将粗品进行纯化，得到纯品100 mg，收率为：[实际值100mg/（理论值1 144×0.45 mmol）]×100%=19.42%，HPLC 图谱如 图3 所示，HR-QTOF-MS 质谱图中对应的[M+H]+峰1 145.744 4，[M+Na]+峰1 167.726 6 显示的分子量与直链肽auyuittuqamide A 相吻合。

图3 Auyuittuqamide A 全保护直链肽HPLC (A)和HR-Q-TOF-MS (B)谱图

本步是将直链肽纯品进行环合，得到油状物粗品，再将粗品进行纯化，得到纯品30 mg，此步收率为：[实际值30mg/（理论值1 126×0.45 mmol）]×100%=5.92%，HPLC 图谱如图4 所示，HR-Q-TOFMS 质谱图中对应的[M+H]+峰1 127.734 6，[M+Na]+峰1 149.715 9 显示的分子量与auyuittuqamide A 直链肽环合后分子量相吻合。

图4 直链肽环合后HPLC (A)和HR-Q-TOF-MS (B)谱图

本步是将环合后纯品脱除侧链保护基，得到油状物粗品，再用乙腈和水溶解，最后冻干得到纯品25 mg，收率为：[实际值25mg/（理论值1 014×0.45mmol）]×100%=5.48%，HPLC 图谱如 图5 所示，HR-Q-TOF-MS 质谱图中对应的[M+H]+峰1 015.611 5，[M+Na]+峰1 037.593 7 显示的分子量与环肽auyuittuqamide A 分子量相吻合。

图5 Auyuittuqamide A 纯品的HPLC(A)和 HR-Q-TOF-MS(B)谱图

2.2 Auyuittuqamide A 的核磁共振氢谱表征

本研究通过500MHz 核磁共振氢谱对环肽进一步表征，确认与文献中auyuittuqamide A 的核磁共振氢谱相符。1H-NMR (500MHz,d-DMSO)δ:8.91 (d,J=9.85 Hz,1H),8.70 (d,J=9.5Hz,1H),8.55 (d,J=6.95 Hz,1H),7.75 (t,J=5.5 Hz,1H),7.47−7.43 (m,3H),7.27−7.17 (m,5H),5.01 (d,J=9.75 Hz,1H),4.88 (m,1H),4.59−4.52 (m,2H),4.45(t,J=9.15 Hz,1H),4.39 (t,J=8.8 Hz,1H),3.32(dd,J=4.3 Hz,1H),3.88−3.82 (m,2H),3.78 (t,J=6.5 Hz,2H),3.74 (d,J=4.45 Hz,1H),3.33−3.27 (m,4H),3.22 (s,3H),3.17−3.13 (m,4H),2.98−2.93 (m,1H),2.48−2.45 (m,7H),1.97 (m,1H),1.87−1.82 (m,2H),1.64−1.60 (m,2H),1.20−1.13 (m,3H),1.01 (d,J=6.5 Hz,3H),0.86 (d,J=5.75 Hz,3H),0.82−0.78(m,17H),0.76−0.72 (m,5H),0.70 (d,J=6.45 Hz,3H)。

3 讨论

本法采用先固相合成直链肽，再液相进行环合获得目标产物auyuittuqamide A。并且采用先环合，再脱除侧链保护基，从而有效地避免了侧链裸露的羟基对环合时的影响[20]。使用高效液相色谱进行纯化，得到纯品纯度大于95%，收率为5.48%的目标产物auyuittuqamide A。本研究首次完成了对auyuittuqamide A 的全合成，本法优点：更为省时，方法简单，易于操作，且经济实用。缺点：产率还有待提高，方法需进一步优化。总的来说，本方法为该类环肽化合物的全合成提供了参考。