宁夏部分地区奶牛场犊牛腹泻病原调查分析

黎玉琼，郭亚男，2*,牛晓昊，2，黄 亮

(1.宁夏农林科学院动物科学研究所，宁夏银川 750002；2.宁夏大学农学院，宁夏银川 750021；3.宁夏农垦贺兰山奶业有限公司，宁夏银川 750021)

犊牛腹泻是犊牛养殖中极其常见的一种病症，也是犊牛培育过程中的重要难题，很容易造成犊牛生长发育不良[1]。由于其具有较高的发病率和死亡率，因此每年给肉牛养殖业带来极大经济损失[2-3]。引起犊牛腹泻的病因极其复杂，包括感染性因素和非感染性因素[2]。非感染性因素主要包括饲喂不当、护理不当或饲养环境恶劣等饲养管理方面的因素[4]；感染性因素主要包括产毒素性大肠埃希氏菌、沙门氏菌、轮状病毒、冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒、隐孢子虫以及球虫等的感染，临床上常呈现2种以上病原的混合感染[4-5]。犊牛发生腹泻时，养殖技术人员常主观判断病因为大肠埃希氏菌、沙门氏菌等细菌感染，以及轮状病毒等病毒感染，忽视或不大考虑寄生虫感染如贾第鞭毛虫、球虫和隐孢子虫。事实上，在临床中引起犊牛腹泻的原因较为复杂，包括犊牛自身免疫力、所处环境、营养以及传染性因子等多种因素，是这些因素相互作用的结果。因此，准确及时诊断犊牛腹泻的病因尤为重要。

奶牛和肉牛产业为宁夏地区的优势产业，在国内肉牛和奶牛养殖量和养殖水平上均名列前茅，但是犊牛腹泻问题一直是困扰养殖户的重要难题之一。因此，本研究通过对宁夏地区10个规模化养殖场0～60日龄132份头腹泻犊牛粪便样本进行隐孢子虫、轮状病毒、冠状病毒、大肠埃希氏菌K99、贾第鞭毛虫和球虫进行病原学调查，旨在掌握宁夏地区致犊牛腹泻的主要病原体及常发年龄段，为犊牛腹泻病的诊断和治疗及疾病的预防和控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 BoviD-5 Ag Test Kit(轮状病毒、冠状病毒、隐孢子虫、大肠埃希氏菌K99、贾第鞭毛虫)(RG1302DD)，韩国安捷公司产品；氯化钠，天津市鼎盛鑫化工有限公司产品。

1.1.2 主要仪器设备 麦氏虫卵计数板(A3875)，中国农业科学院兽医研究所产品；显微镜(CX31)，日本奥林巴斯公司产品。

1.2 方法

1.2.1 粪便采集 通过直肠采集腹泻犊牛粪便，记录牛场、牛号、出生日期。共采集了10个规模化牛场0～60日龄犊牛粪便共计132份。

1.2.2 病原检测 轮状病毒、冠状病毒、隐孢子虫、大肠埃希氏菌K99、贾第鞭毛虫检测：用棉签收集粪便，将粪便插入试管并搅拌10次，室温静止1 min，用吸管小心吸取上清液并加入4滴混合液，10 min后判断结果。

球虫检测：根据麦克马斯特法[6]计算每克粪便中的卵囊数(oocysts per gram of feces，OPG)。取粪便2 g，放入烧杯中，先加水5 mL，搅拌混匀后，加饱和食盐水至60 mL，混匀后用铜筛网过滤，吸取粪液，注入麦克马斯特计数板的计数室内，静置5 min后，在显微镜下计数2个刻度室中的卵囊数。2个计数室的虫卵数的平均值乘以200，即为每克粪便中的虫卵或卵囊数(OPG=(n1+n2)/2/0.15×60/2 =A×200 其中(n1+n2)/2为平均每个计数室内卵囊数A，0.15为每个计数室有效体积为0.15 mL，60为粪液总体积为60 mL，2为所用粪便克数为2 g)。

1.2.3 统计分析 采用Excel软件对检测到的不同病原体进行单一感染率、混合感染率、发病时间和时间轴进行初步分析；采用SAS 8.2统计分析软件中的卡方检验进行差异性分析。

2 结果

2.1 不同牧场6种病原检测结果

不同牧场腹泻犊牛6种病原检出病原数、病原种类和检出率见表1。132份样品中共检出95份阳性粪便，6种病原平均检出率为71.96%。不同牧场检出率各不同，最低检出率33.33%，最高检出率为100%。牧场1、3、4、5、6、10病原检出率差异不显著(P>0.05)；牧场2、7与牧场1、6、10病原检出率差异显著(P<0.05)；牧场8、9与牧场2、6、10病原检出率差异极显著(P<0.01)。

表1 不同牛场腹泻犊牛6种病原检测结果

2.2 不同病原阳性率

通过对不同病原检出结果进行统计，结果如表2所示，95份阳性样本中，隐孢子虫感染样本38份，占40.00%；轮状病毒感染样本41份，占43.16%；冠状病毒感染样本33份，占34.74%；大肠埃希氏菌K99感染样本3份，占3.16%；贾第鞭毛虫感染24份，占25.26%；艾美耳球虫感染样本5份，占5.26%。隐孢子虫、轮状病毒和冠状病毒之间的样本阳性率差异不显著(P>0.05)；隐孢子虫和轮状病毒样本阳性率与大肠埃希氏菌K99样本阳性率差异极显著(P<0.01)；贾第鞭毛虫样本阳性率与隐孢子虫、轮状病毒、大肠埃希氏菌K99、球虫样本阳性率差异极显著(P<0.01)。

表2 6种病原阳性率统计结果

2.3 单一感染和混合感染统计分析

在检出的阳性样品中，单一感染阳性样品共58份，占61.05%。其中隐孢子虫所占比例最大，占21.05%(20/95)；轮状病毒占13.68%(13/95)，贾第鞭毛虫12.63%(12/95)，冠状病毒占6.32%(6/95)，大肠埃希氏菌K99占6.32%(3/95)。隐孢子虫阳性率与冠状病毒和大肠埃希氏菌阳性率差异极显著(P<0.01)；轮状病毒、冠状病毒、大肠埃希氏菌K99、贾第鞭毛虫、球虫之间的阳性率所占比例差异不显著(P>0.05)(表3)。

2种病原混合感染样品共27份，占28.42%。其中轮状病毒和冠状病毒占10.53%(10/95)，比例最大；隐孢子虫和轮状病毒占6.32%(6/95)；轮状病毒和贾第鞭毛虫占2.11%(2/95)；冠状病毒和贾第鞭毛虫占6.32%(6/95)；隐孢子虫和冠状病毒占3.16%(3/95)。轮状病毒和冠状病毒混合感染阳性率与轮状病毒和贾第鞭毛混合感染虫阳性率、隐孢子虫和冠状病毒混合感染阳性率差异显著(P<0.05)(表3)。

3种病原混合感染样本共10份，占10.53%。其中隐孢子虫、轮状病毒、冠状病毒占7.37%(7/95)；隐孢子虫、轮状病毒、贾第鞭毛虫占2.11%(2/95)；隐孢子虫、冠状病毒、贾第鞭毛虫占1.05%(1/95)。不同3种病原混合感染样本阳性率之间差异不显著(P>0.05)(表3)。

表3 6种病原混合感染统计结果

2.4 不同疾病发病日龄统计分析

6种病原最早发病时间和常发日龄如图1所示。隐孢子虫最早发病日龄为5日龄，常发日龄在5日龄～21日龄。冠状病毒最早发病日龄为5日龄，常发日龄在5日龄～27日龄。轮状病毒最早发病日龄为5日龄，常发日龄在5日龄～18日龄。贾第鞭毛虫最早发病日龄为8日龄，常发日龄在24日龄～60日龄；球虫最早发病日龄为30日龄，在犊牛整个生命周期中均可发病；大肠埃希氏菌最早发病日龄为0日龄，常发日龄为0～7日龄。

图1 6种疾病常发时间轴

3 讨论

麦克马斯特氏法检测粪便球虫卵囊数虽然是比较传统的方法，但是该方法不仅可以准确地观察到球虫，而且可以对球虫种类进行直观的形态学观察和卵囊大小的测量。因为判断球虫病不仅要检测球虫数量，还要检测致病性虫种。该方法成本最低，而且检测时间较短，视为球虫检测的金标准。轮状病毒、冠状病毒、大肠埃希氏菌K99和贾第鞭毛虫为初生犊牛常发的腹泻性病原，这几种病原的快速检测可以达到针对疾病精准治疗,降低犊牛死亡率，减少经济损失的目的。本研究采用胶体金病原检测试纸进行病原学检测，10 min～15 min即可快速检出病原。

本研究对引起0～60日龄内犊牛腹泻的6种病原进行调查，发现132份样品共检出95份阳性粪便，6种病原平均检出率为71.96%。10个牧场检出率各不相同，最低检出率33.33%，最高检出率为100%。其中，隐孢子虫占40.00%，轮状病毒占43.16%，冠状病毒占34.74%，大肠埃希氏菌K99占3.16%，贾第鞭毛虫占25.26%，艾美耳球虫占5.26%，说明犊牛腹泻病原中轮状病毒比例最大，其次是隐孢子虫、贾第鞭毛虫、球虫和大肠埃希氏菌。隐孢子虫、轮状病毒和冠状病毒之间的样本阳性率差异不显著(P>0.05)；隐孢子虫和轮状病毒样本阳性率与大肠埃希氏菌K99样本阳性率差异极显著(P<0.01)；贾第鞭毛虫样本阳性率与隐孢子虫、轮状病毒、大肠埃希氏菌K99、球虫样本阳性率差异极显著(P<0.01)。本研究结果与王文佳等[1]2017对宁夏部分地区犊牛腹泻4病原调查中的轮状病毒比例最大，其次是隐孢子虫等结果一致，但本研究的结果多出了冠状病毒和球虫检测结果。

本研究发现，单一感染阳性样品中隐孢子虫所占比例最大，其次是轮状病毒、贾第鞭毛虫、冠状病毒、大肠埃希氏菌K99；隐孢子虫阳性率与冠状病毒和大肠埃希氏菌阳性率差异极显著(P<0.01)；轮状病毒、冠状病毒、大肠埃希氏菌K99、贾第鞭毛虫、球虫之间的阳性率差异不显著(P>0.05)。2种病原混合感染中以轮状病毒和冠状病毒所占比例最大，其次是隐孢子虫和轮状病毒、轮状病毒和贾第鞭毛虫、冠状病毒和贾第鞭毛虫、隐孢子虫和冠状病毒；轮状病毒和冠状病毒混合感染阳性率与轮状病毒和贾第鞭毛混合感染虫阳性率、隐孢子虫和冠状病毒混合感染阳性率差异显著(P<0.05)。3种病原混合感染中隐孢子虫、轮状病毒、冠状病毒比例最大，其次是隐孢子虫、轮状病毒、贾第鞭毛虫，隐孢子虫、冠状病毒、贾第鞭毛；不同3种病原混合感染样本阳性率之间差异不显著(P>0.05)。本研究说明隐孢子虫在单一感染中为主要发病病原。轮状病毒和冠状病毒为混合感染的主要病原。但是0～30日龄犊牛球虫病发病率极低，主要是其他5种病原。3种病原混合感染中以隐孢子虫、轮状病毒和冠状病毒混合为主，因此犊牛腹泻病原中应主要注意隐孢子虫、轮状病毒和冠状病毒这3种病原引起的腹泻，对于贾第鞭毛虫和球虫等寄生虫性腹泻应采取环境消毒、保持圈舍清洁和早期驱虫等措施来预防控制疾病的发生。

本研究通过对不同日龄犊牛6种病原流行病学调查，首次建立了适合宁夏地区的6中常见病原的最早发病时间和常发日龄图谱，可为宁夏地区犊牛腹泻的预防和治疗提供科学依据。