我国对非洲猪瘟病毒的研究进展综述

倪俊芬 陈前岭 仲向前

（1泗阳县畜牧兽医站，江苏宿迁 223700；2宿迁市畜牧兽医站，江苏宿迁 223899）

非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）已在我国“定殖”，且周边国家的非洲猪瘟疫情也是多发频发，对养猪企业仍存在较大威胁，非洲猪瘟疫情的防控形势依然严峻[1,2]。目前，全球仍无非洲猪瘟疫苗上市，防控非洲猪瘟仍需靠猪场严格的生物安全[3]。因此，全面了解非洲猪瘟病毒是防控疫病和研发疫苗较为有效的手段，我国已有科研单位、高校在解析非洲猪瘟病毒[4,5]。了解非洲猪瘟病毒基因特征，对防控非洲猪瘟有重要意义[6]。

非洲猪瘟病毒是一种双链DNA分子病毒，基因组长为170～190 kb[7]，编码150～200种病毒蛋白，其中有68中结构蛋白和100余种非结构蛋白。经解析，非洲猪瘟病毒颗粒由内向外依次为病毒基因组、核衣壳、内膜、衣壳和外膜组成。拟核基因组包括病毒基因组合核蛋白，其主要蛋白有DNA结合蛋白p10和pA104R；核衣壳主要蛋白有p150、p37、p35、p34、p14和p15等6种；内膜蛋白有 pE183R、p12、p17、pE183L、p54等；衣壳主要蛋白由p72、p49、p14.5等组成；外膜的主要蛋白为CD2v。科研工作者对非洲猪瘟病毒的主要结构蛋白位置和功能进行了深入研究，为非洲猪瘟病毒的快速检测和疫苗研发提供了大量数据支撑。如郭怡德等[8]对非洲猪瘟病毒的重要毒力蛋白、非结构蛋白等进行总结分析，发现在病毒形态维持、病毒吸附与入侵宿主细胞、病毒复制、病毒对宿主细胞代谢调控及免疫逃逸等方面有50余个结构蛋白参与。

1 非洲猪瘟病毒功能基因的研究

非洲猪瘟病毒中已经明确功能的有68个蛋白，且这些蛋白分布在病毒颗粒不同的位置[9]。如p54、p12、p17等属于内膜蛋白；p72是主要的衣壳蛋白；CD2v蛋白是典型的外膜蛋白等。68个功能蛋白中参与复制的蛋白约30个，其余为参与诱导凋亡、破坏凝血、病毒吸附、免疫逃逸等，同时仍有大部分非洲猪瘟病毒基因功能仍处于未知状态[10]。在这些蛋白中，有些蛋白有利于非洲猪瘟病毒的检测；有些有利于蛋白功能结构的研发，为非洲猪瘟病毒的防控和杀灭提供参考；而还有一些则更有利于疫苗研发。因此，分析非洲猪瘟病毒蛋白的功能结构，旨在为非洲猪瘟的防控和疫苗研发提供理论参考。

2 非洲猪瘟病毒的致病基因

2021年之前，为了更好地防控非洲猪瘟病毒，多数科研工作者以研究非洲猪瘟病毒的致病机理和非洲猪瘟病毒蛋白的表达为主，以期能够更精准的检测到非洲猪瘟病毒。多数学者认为CD2v蛋白是快速检测非洲猪瘟病毒、研发非洲猪瘟疫苗的一个有效目的蛋白。如何庆等[11]对非洲猪瘟病毒的CD2v的结构及其生物学功能进行分析，阐明非洲猪瘟病毒的致病机理。田盼盼等[12]运用各种生物信息学技术分析了非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的理化性质、信号肽、跨膜区、抗原性等，发现CD2v蛋白是亲水性的分泌蛋白，具有免疫原性且为非过敏原。凌占业等[13]通过真核表达非洲猪瘟病毒的CD2v重组蛋白，建立了一种快速的ASFV间接ELISA检测方法。

非洲猪瘟病毒由于分子量较大而通过呼吸道、消化道等传播，因此，在非洲猪瘟病毒的检测中，特异性目的基因片段的确定也很重要。侯景等[14,15]在研究非洲猪瘟病毒时发现，生猪感染非洲猪瘟病毒后，在第5 d会检测出非洲猪瘟病毒解旋酶D1133L的抗体，第7 d该基因抗体达到高峰值。同时，还通过预测分析和亚细胞定位等方法解析了非洲猪瘟病毒解旋酶D1133L的基因结构和功能，为后续进一步解析D1133L基因的功能和亚细胞结构奠定基础。张鑫宇等[16]构建了非洲猪瘟病毒重组蛋白pK205R、pE183L、pA104R和pB602L等的多克隆抗体，筛选出p54和pK205R重组蛋白是较好的诊断抗原，可用于非洲猪瘟病毒感染后的早期或中后期血清学诊断。孙茂文等[17]、向志达等[18]发现非洲猪瘟病毒的A137R蛋白多克隆抗体，具有较好的免疫原性、反应性和特异性，为后续解析非洲猪瘟病毒的A137R蛋白功能和建立ASFV血清学检测方法奠定基础。武悦等[19]构建非洲猪瘟多基因家族MGF-505-3R基因重组原核表达质粒，并进行表达。发现MGF-505-3R蛋白为不稳定的疏水蛋白，为我国非洲猪瘟免疫血清学诊断试剂的制备及预防控制奠定了基础。此外，韩程程等[20]利用非洲猪瘟病毒的p54基因蛋白作为检测目标，设计了Spinach-p54的嵌合式RNA适配体，实现了在RNA水平对非洲猪瘟病毒的快速检测，且可用于市场和养殖场的现场快速检测。曾宇晨等[21]建立了基于酶促重组酶扩增技术的非洲猪瘟病毒DNA快速检测方法，为非洲猪瘟的流行病学调查和现场检测提供了一种快速有效的检测方法。

3 有利于非洲猪瘟病毒检测的蛋白

目前，用于检测非洲猪瘟病毒的蛋白种类较多，选择一种灵敏度高、准确性好的目的蛋白建立非洲猪瘟病毒的ELISA检测方法，便于养殖企业自行检测显得尤为重要。程佳等[22]利用非洲猪瘟病毒EP153R蛋白建立了间接检测非洲猪瘟病毒蛋白的ELISA方法，并通过验证发现其有较强的特异性和较好的重复性。邬旭龙等[23]通过原核表达ASFVpK205R重组蛋白，建立了一种快速的ASFV间接ELISA检测方法。王彩霞等[24]利用真核表达的非洲猪瘟病毒p72蛋白为包被抗原，建立了特异性检测ASFV抗体的阻断ELISA方法。王兆贵等[25]筛选以非洲猪瘟病毒pA104R蛋白作为最佳诊断抗原，用于检测非洲猪瘟病毒的间接ELISA方法。

此外，在非洲猪瘟病毒蛋白的ELISA检测中，抗体的选择和制备也很重要，选择正确的抗体可以更好地检测出病毒，并可以提高检测的准确性。颜世君等[26]为研发非洲猪瘟病毒的免疫诊断学试剂，制备了抗p22蛋白单克隆抗体。赵少若等[27]通过研究制备了p11.5蛋白的特异性单克隆抗体；白晶晶等[28]通过重组法制备了非洲猪瘟病毒p17蛋白的单克隆抗体；耿笑林等[29]制备了非洲猪瘟病毒K145R蛋白的单克隆抗体，赵亚茹等[30]合成了非洲猪瘟病毒K205R基因的单克隆抗体，王西西等[31]制备了DP96R重组蛋白的多克隆抗体；陈蓉等[32]重组了非洲猪瘟病毒p10蛋白和多克隆抗体；李佳佳等[33]制备了非洲猪瘟病毒H240R基因的多克隆抗体，杨博等[34]制备了非洲猪瘟病毒MGF360-9L蛋白的多克隆抗体，李杰等[35]制备了非洲猪瘟病毒p30-54基因融合蛋白的多克隆抗体，这些蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体的制备，为建立非洲猪瘟病毒抗体、抗原诊断产品的研究提供了重要的生物材料。

在非洲猪瘟病毒单克隆或多克隆抗体的检测中，运用p30病毒蛋白制备抗体的频率相对较高。如黄剑等[36]利用非洲猪瘟病毒p30结构蛋白中的CP204L基因，制备了多克隆抗体，并对抗体进行了表达，为p30蛋白结构功能研究奠定了基础。刘靖等[37]构建了表达非洲猪瘟病毒p30蛋白的细胞系、纯化p30蛋白并制备单克隆抗体（MAb），为ASFV p30蛋白的深入研究及ASFV的快速检测奠定了基础。吴竞等[38]对非洲猪瘟病毒的p30基因进行了原核表达，并建立间接ELISA检测方法，可初步应用于非洲猪瘟病毒抗体的检测。同时，p35[39]、p54[40]、p72[41]、pB602L[42]、pK145R[43]、pK205R[44]等蛋白在检测非洲猪瘟病毒中也起着非常重要的作用，为进一步研发非洲猪瘟血清学诊断方法提供了参考依据。

4 有利于疫苗研发的非洲猪瘟病毒基因

当前，非洲猪瘟病毒的衣壳蛋白是研发疫苗的关键蛋白，据报道，非洲猪瘟病毒的衣壳蛋白主要成分是p72，此外还有五邻体顶点蛋白（H240R）及3种不同的次要衣壳蛋白（Minor capsid protein）[45]。因此，对非洲猪瘟病毒衣壳蛋白基因的解析，成为研发非洲猪瘟疫苗的参考依据和思路，研究发现，非洲猪瘟病毒核衣壳的主要蛋白p72中存在可以制备疫苗的候选基因位点，如高瞻等[46]为预测非洲猪瘟病毒2018/AnhuiXCGQ株p72蛋白的T、B淋巴细胞抗原表位，对该蛋白的理化性质、二级结构、三级结构进行预测分析，统计设计多表位疫苗，发现p72蛋白具有多个潜在的抗原表位，为构建非洲猪瘟多表位疫苗提供了依据。胡永新等[47]通过合成P72蛋白中的B646L基因，并将该基因与腺病毒骨架载体进行重组，经细胞传代后获得重组腺病毒，为非洲猪瘟腺病毒疫苗的研制奠定了一定基础。此外，非洲猪瘟病毒的五邻体顶点蛋白（H240R）也是疫苗研究的一个候选基因，王国强等[48]原核表达非洲猪瘟病毒次要衣壳五邻体顶点蛋白（H240R），并研究其免疫原性。发现ASFV衣壳五邻体顶点蛋白H240R在原核系统中以包涵体形式表达，纯化复性的目的蛋白具有良好的免疫原性，并且可以和阳性血清反应。这些可为进一步研究H240R蛋白的结构和功能，以及ASFV亚单位疫苗研制提供参考和思路。

此外，研究发现，一种由EP402R基因编码的糖蛋白CD2v在ASFV病毒入侵宿主和传播扩散中发挥重要作用。因此，大多科研工作者通过CD2v蛋白在研发一些非洲猪瘟病毒的基因缺失疫苗和基因重组疫苗。何庆等[49]对ASFV的CD2v结构及其生物学功能研究报道进行分析综述，将为阐明疫苗研发等提供重要参考。张霁辉等[50]通过非洲猪瘟病毒的CD2v蛋白构建了核酸重组疫苗，通过评价发现，构建的核酸疫苗可以提高小鼠机体的免疫应答。此外，当非洲猪瘟病毒感染猪只后，引起猪器官发生炎症反应，而病毒中的一些非结构蛋白则可以诱导机体干扰素的产生，如MGF多基因家族中的一些基因，因此，MGF多基因家族在疫苗研发中具有重要的作用。蔡建秋等[51]分析了非洲猪瘟病毒中国Pig/HLJ/2018分离株MGF多基因家族的42条编码蛋白的二级结构、B细胞抗原表位区域、T细胞抗原表位区域分析，筛选出25条优势B细胞抗原表位序列、20条优势T细胞抗原表位序列，这些B、T细胞抗原表位区域为构建非洲猪瘟多表位疫苗提供了基础依据。蒋亚君等[52]重组了非洲猪瘟病毒的MGF360-12L基因，并在鉴定中发现12L重组蛋白具有较好的稳定性，为非洲猪瘟病毒的疫苗研发提供了生物材料。除以上基因外，还有一些基因也是非洲猪瘟疫苗研发的重点基因，如非洲猪瘟病毒p49蛋白的B438L基因[53]、非洲猪瘟病毒的pI215L 蛋白[54]等。

5 其他

当前，仍没有可以普及推广的非洲猪瘟疫苗，因此，早期猪群的检测和生物安全防控，仍旧是防控非洲猪瘟的主要手段。而科研工作者对非洲猪瘟病毒毒株及基因的解析仍在继续，且在为非洲猪瘟疫苗的研发不断积累依据。如张彦兵等[55]通过分析非洲猪瘟病毒不同毒株E165R基因启动子序列，发现E165R启动子含有3个活性区域，为解析E165R基因提供参考。杨博等[33]对非洲猪瘟病毒多基因家族中MGF360-9蛋白的研究为对非洲猪瘟病毒的靶向药物和疫苗的研发提供了参考依据。

6 小结

综上所述，科研人员对非洲猪瘟病毒基因的解析已积累了较多的数据，为后期我国非洲猪瘟的快速检测和疫苗的研发提供了大量依据。尽管非洲猪瘟病毒基因的解析不断完善，但养猪企业不应将希望寄托于疫苗的研发，还是应做好养猪场的生物安全防控，并注重养殖技术人员的素质提升，防患于未然，保证养猪产业的健康发展。