外源EBR对烤烟成熟期氮代谢及烟碱代谢的影响

张帅涛，李举旭，李 满，王卫民，王 冬，常剑波，夏宗良，张小全*

1.河南农业大学烟草学院，郑州市平安大道218号 450046

2.浙江中烟工业有限责任公司，杭州市中山南路77号 310024

3.中国烟草总公司河南省公司，郑州市商务外环路15号 450018

4.河南省烟草公司三门峡市公司，河南省三门峡市崤山路中段 472000

烟碱是影响烟叶品质和卷烟质量的重要成分［1］，烤烟烟碱含量高低受遗传［2-3］、生态环境［4-5］、移栽期和施肥［6-8］等因素的影响。烟叶生产中通常遵循“少时富、老来贫”的烤烟氮素需求规律进行施肥，以避免成熟期土壤中氮素过多，烟叶贪青晚熟，烤后烟叶烟碱含量偏高［9-11］。然而，近年来在我国部分烟区，烟叶生长后期常遭遇持续低温多雨天气，烟叶采收推迟，出现了上部烟叶烟碱含量偏低，工业可用性下降等亟待解决的问题［7，12-13］。

研究表明，烟叶中烟碱累积量与根际氮素供应量呈极显著正相关关系［13］。烤烟打顶后，烟株根系可持续吸收利用土壤中的氮素合成烟碱，但如果根际氮素缺乏，下部叶中的氮素会向根系迁移，并在根系中合成烟碱后由木质部向上运输［14-15］。氮素迁移过程中氮素吸收和同化的关键酶硝酸还原酶（NR）和谷氨酸脱氢酶（GDH）以及氮素转运和再分配关键酶谷氨酰胺合成酶（GS）等发挥着重要作用［16］。此外，烟碱在烟株根部合成受NtPMT、NtQPT 等关键基因调控，在根部和叶片中的转运主要受NtNUP1、NtJAT1、NtJAT2等关键基因调控［17］。

2，4-表油菜素内酯（2，4-epibrassinolide，EBR）是广泛使用的一种人工合成的油菜素内酯类植物生长调节剂，参与调控烟草的生长发育过程，可促进烟草根系发育、提高光合效率、提高抗逆性等［18-26］。韩锦峰等［20-21］和齐群钢等［22-23］通过盆栽和水培方式研究发现，EBR 可提高烟株的根系活力和叶片的光合能力，改善烟叶的化学成分；王丽君等［24］和许金亮等［25］分别发现外源EBR能改善烟苗对干旱和低温的抗性；李健忠等［26］研究发现喷施EBR 可提高烟草叶片NR 和GS 活性，促进叶片生长发育，增强氮代谢。然而，烤烟打顶后施用EBR对成熟期烤烟氮代谢、烟碱代谢以及烤后烟叶烟碱含量的影响却鲜有报道。因此，通过大田试验，研究叶面喷施和灌根两种施用方式下外源EBR 对烤烟成熟期叶片光合性能、干物质积累、氮代谢相关酶活性、烟碱代谢相关基因表达量和烤后烟叶化学成分含量的影响，旨在为利用外源EBR 调节成熟期烟株氮代谢和烟碱代谢，提高烟叶烟碱含量等提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地点、材料与试剂

试验于2021年在河南省三门峡市灵宝市朱阳镇梁家庄村（N110.41°，E34.19°）进行。试验地前茬为烟草，土壤类型为黄壤土，土壤pH 7.65，土壤中有机质含量为15.24 mg/kg、碱解氮含量为86.50 mg/kg、速效钾含量为54.88 mg/kg、速效磷含量为15.36 mg/kg。试验田在起垄前撒施腐熟牛粪6 000 kg/hm2，移栽前穴施有机无机生物一体肥375 kg/hm2和硫酸钾105 kg/hm2。

供试烤烟品种为云烟87。5月12 日移栽烟苗，移栽后第30 d，每株灌根10.00 g/L 发酵豆浆粉、20.00 g/L 有机无机生物一体肥、4.00 g/L 硫酸钾、4.00 g/L硝酸钾的混合水溶液0.50 L。

试验用EBR原液（0.1 g/L）由河北兰升生物科技有限公司生产，叶面喷施EBR 溶液按照10 mL 原液兑水定容至5 L（浓度0.2 mg/L）的方法调配而成，灌根用EBR 溶液按照每10 mL 原液兑水定容至10 L（浓度0.1 mg·L-1）的方法调配而成。有机无机生物一体肥［有机质含量（质量分数）≥40%，mN∶mP2O5∶mK2O=10∶12∶18］由三门峡龙飞生物工程有限公司生产。发酵豆浆粉由三门峡鑫鼎农业科技有限公司生产［27］。硫酸钾由国投新疆罗布泊钾盐有限责任公司生产。硝酸钾由山西金兰化工股份有限公司生产。

1.2 试验设计

试验采用单因素随机区组设计，共设置3个处理：CK对照处理为叶面喷施清水250 mL/株，同时清水灌根500 mL/株；T1 处理为叶面喷施0.2 mg/L EBR 溶液250 mL，同时清水灌根500 mL/株；T2 处理为叶面喷施清水250 mL/株，灌根0.1 mg/L EBR溶液500 mL/株。烟株第一朵中心花开放50%时（7月18日）统一打顶，单株留叶20片。在打顶当天（移栽后第67 d）进行外施EBR 处理。叶面喷施方法为用手动喷雾器对单株叶面正反面均匀喷施，灌根方法为在垄上距烟株10.0 cm处用直径5.0 cm的削尖木棍打1个深10.0 cm 的洞将溶液灌入。小区面积为60 m2，每小区植烟4 行共100 株，行株距120.0 cm×50.0 cm，田间3 次重复。其他田间管理按当地优质烤烟生产技术规程进行。

1.3 试验取样

外施EBR 处理后第30 d，每处理选取具有代表性的6株烟，3株用于测量中部叶（第12叶位）和上部叶（第18叶位）的光合作用，并将对应的中、上部叶用剪刀在其中部距主脉两侧2 cm 处取10 g 左右鲜叶片，迅速置于液氮中保存，用于相关酶活和基因表达分析。另外3 株用铁锹小心连根挖出，先剪取10 g左右的须根（用去离子水清洗干净），置于液氮中保存，用于相关基因表达分析；再将根、茎、叶分开，称重后放入烘箱中杀青，用于测定干物质积累和杀青样的总氮和烟碱。

烟叶烘烤后，每处理均选取烤后中部烟（C3F）和上部烟（B2F）各1.00 kg，用于常规化学成分含量（质量分数）测定。

1.4 测定方法

光合特性指标测定：上午9：00～11：00使用光合测定仪（LI-6400，美国LI-COR公司）在自然光照条件下测定中部叶和上部叶的净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度和蒸腾速率，设定光强为1 200 µmol/（m2·s），测定环境为开放式气路。

酶活测定：鲜烟叶硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性采用Solarbio检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）的标准方法测定。

基因表达分析：调控氮素吸收的NtNR、氮素转运的NtGDH1、氨同化的NtGS2、氮素转移和再利用的NtGS1-3 基因，调控烟碱合成的NtQPT、NtPMT 和烟碱转运的NtNUP1、NtJAT1、NtJAT2 基因的相对表达量均采用实时荧光定量PCR 法测定，详细测定方法和引物序列信息见文献［28］，所有的样品测定均重复3次，基因相对表达量用2-△△CT方法进行计算。

化学成分含量测定：叶片杀青样总氮和烟碱含量以及烤后烟叶常规化学成分含量采用连续流动化学分析仪（AA3，德国Seal公司）测定。

1.5 数据分析

用Microsoft Excel 2019对试验数据进行整理和绘图，采用SPSS 26.0 软件对数据进行方差分析，用Duncan法对不同处理进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 外源EBR 对成熟期烟株光合能力和干物质积累的影响

外源EBR 对成熟期烟株光合作用的影响见表1。由该表可见，各处理中部叶净光合速率、气孔导度和蒸腾速率与上部叶相比较低。与CK处理相比，T1 和T2 处理的烟株中部叶、上部叶的净光合速率、气孔导度和蒸腾速率均有显著提高，且T1处理极显著高于其他处理。T1 处理中、上部叶胞间CO2浓度显著低于其他两个处理，较CK 处理分别降低了6.61%和4.51%；T2处理中部叶的胞间CO2浓度显著低于CK 处理，而上部叶胞间CO2浓度与CK 处理无显著差异。说明外源EBR可提升成熟期烟株的光合能力，叶面喷施处理的效果好于灌根处理。

表1 外源EBR对成熟期烟株光合能力的影响①Tab.1 Effects of exogenous EBR on photosynthetic capacity of tobacco plants at mature stage

如表2所示，T1 处理单株干物质积累总量显著高于CK 和T2 处理，分别提高了35.65%、14.44%。T1处理根、茎、中部叶和上部叶的干物质积累量均极显著高于CK 处理。T1 处理茎、中部叶和上部叶的干物质积累量显著高于T2。T2 处理根、中部叶、上部叶和单株干物质积累总量显著高于CK 处理。说明外源EBR可增加成熟期烟株的干物质积累量，T1处理对地上部的干物质积累提升效果优于T2处理。

表2 外源EBR对成熟期烟株干物质积累量的影响Tab.2 Effects of exogenous EBR on dry matter accumulation of tobacco plants at mature stage(g·株-1)

2.2 外源EBR 对成熟期烟株不同部位总氮和烟碱含量的影响

外源EBR对成熟期烟株不同部位总氮和烟碱含量的影响见表3。T1和T2处理成熟期烟株根、茎、中部叶和上部叶中总氮含量均显著高于CK 处理。T1处理成熟期烟株根、茎、中部叶和上部叶总氮含量较CK 处理分别提高了5.15%、14.63%、10.79%和14.97%；T2 处理较CK 处理分别提高了15.98%、11.59%、8.99%和10.20%。成熟期各处理不同部位烟碱含量呈现叶＞根＞茎的规律。在叶片中，各处理上部叶的烟碱含量相对较高。T1处理各部位烟碱含量最高，其中根、中部叶和上部叶中的烟碱含量较CK处理分别增加了37.84%、18.28%和41.25%，且与其他处理差异显著。T2 处理中部叶、上部叶和根中的烟碱含量较CK处理分别提高了32.43%、9.68%和36.25%，达到显著水平。T1和T2处理茎中的烟碱含量无差异，均显著高于CK 处理。结果表明，外源EBR可显著提高成熟期烟株叶片中的总氮和烟碱含量，并且效果受施用方式影响。

表3 外源EBR对成熟期烟株不同部位总氮和烟碱含量的影响Tab.3 Effects of exogenous EBR on total nitrogen and nicotine contents in different parts of tobacco plants at mature stage （%）

2.3 外源EBR 对成熟期叶片硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的影响

外源EBR 对成熟期烤烟叶片硝酸还原酶（NR）和谷氨酰胺合成酶（GS）活性的影响如图1所示。T1处理中部叶和上部叶的NR 活性相较CK 处理分别提高了30.21%和37.51%，达到极显著水平。T2处理中部叶和上部叶NR 活性较CK 处理分别提高20.62%和24.97%，其中中部叶与CK 的差异达到显著水平，上部叶与CK 的差异达到极显著水平。T1处理中、上部叶GS 活性较CK 处理分别提高了106.77%、156.12%，且差异均达到极显著水平。T2处理中部叶GS 活性与CK 处理无明显差异，而上部叶GS 活性相比CK 处理提高了101.65%，差异达极显著水平。说明外源EBR可以提高成熟期烤烟叶片硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性。

图1 外源EBR对成熟期叶片硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的影响Fig.1 Effects of exogenous EBR on activities of nitrate reductase and glutamine synthetase in tobacco leaves at mature stage

2.4 外源EBR 对成熟期烟株氮代谢和烟碱代谢相关基因表达的影响

由图2可见，T1 处理中部叶中调控氮代谢的NtNR、NtGDH1 和NtGS2 基因的相对表达量较CK 处理分别提高了2.27 倍、5.28 倍和1.24 倍，上部叶中3个基因的表达量较CK处理分别提高了4.32倍、3.76倍和6.63 倍，且都极显著高于CK 和T2 处理。中部叶中NtGS2 基因相对表达量远低于上部叶，说明随着叶片成熟NtGS2基因相对表达量降低。T2处理中部叶、上部叶中NtNR 和NtGDH1 基因相对表达量均显著高于CK处理，T2处理中部叶中NtGS2基因相对表达量与CK处理无显著差异，而与上部叶的差异达到极显著水平。因此，叶面喷施和灌根施入EBR 均可提高成熟期烟株叶片的氮素吸收、同化和转运能力，其中叶面喷施更有利于成熟期烟株的氮素代谢。

中部叶调控氮素转移和再利用基因NtGS1-3 的相对表达量与上部叶相比较高（图2C），T1处理中部叶中NtGS1-3 基因相对表达量显著低于CK 处理，上部叶极显著低于CK 和T2 处理；T2 处理中部叶中NtGS1-3 基因相对表达量极显著高于CK 处理，上部叶极显著低于CK 处理。因此，叶面喷施EBR 可影响成熟期叶片中氮素的转移和再利用，有利于氮素的积累。

图2 外源EBR对成熟期烟株氮代谢相关基因表达的影响Fig.2 Effects of exogenous EBR on expression levels of nitrogen metabolism related genes of tobacco plants at mature stage

由图3A 和图3B 可知，烟碱合成基因NtQPT 在叶片和根中均有表达，且在根中的表达量高于叶片；中部叶、上部叶和根中的NtQPT 基因相对表达量在T1、T2 和CK 处理间的差异均达极显著水平，且T1＞T2＞CK处理。未检测到NtPMT在叶片中的表达，T1和T2 处理NtPMT 基因在根中的相对表达量均极显著高于CK处理，T1和T2处理间差异不明显。因此，外源EBR可提高烟株成熟期烟碱的合成能力。

图3 外源EBR对成熟期烟株烟碱代谢相关基因表达的影响Fig.3 Effects of exogenous EBR on expression levels of nicotine metabolism related genes of tobacco plants at mature stage

由图3C、图3D 和图3E 可知，烟碱转运基因NtNUP1 在根中相对表达量高于叶片，NtJAT1 和NtJAT2 在叶片中的表达量高于根中的表达量。T1处理叶片中NtNUP1 基因相对表达量极显著高于其他两个处理，T2 处理叶片中NtNUP1 基因相对表达量极显著高于CK 处理。T1 和T2 处理根中NtNUP1基因相对表达量极显著高于CK处理，说明外源EBR可使烟株根部合成的烟碱更多地运输至叶片中。T1和T2 处理根中NtJAT1 和NtJAT2 基因相对表达量差异不显著，但均极显著高于CK 处理。中、上部叶NtJAT1 和NtJAT2 基因相对表达量在T1、T2 和CK处理间的差异均达极显著水平，且T1＞T2＞CK处理。说明外源EBR 能有效提高烟碱在烟株中的转运能力。

2.5 外源EBR对烤后烟叶化学成分的影响

由表4可知，T1处理中、上部烤后烟叶中总氮含量较CK处理分别提高了6.59%、8.43%，烟碱含量较CK 处理分别提高了14.29%、16.74%，且均极显著高于CK 处理。T2 处理中部叶总氮含量较CK 处理提高了4.19%，达到显著水平，烟碱含量无明显差异，上部叶总氮和烟碱含量显著高于CK处理，较CK分别提高4.49%和8.14%。T1 和T2 处理中、上部叶总糖和还原糖含量均极显著低于CK处理。T1和T2处理中部叶钾含量无明显差异，且均显著高于CK 处理。T1处理上部叶钾含量显著高于T2和CK处理。说明外源EBR 可提高烤后烟叶总氮和烟碱含量，且叶面喷施EBR提高烤后烟叶烟碱含量的效果更显著。

表4 外源EBR对烤后烟叶化学成分的影响Tab.4 Effects of exogenous EBR on key chemical components in cured tobacco leaves（%）

3 讨论

在烟叶成熟期低温多雨的河南省三门峡市灵宝烟区，烤烟打顶后通过叶面喷施或灌根的方式施用外源EBR 可提升成熟期烟株的光合能力，增加烟株各部位的干物质积累量，提高叶片中的总氮和烟碱含量，显著提升中部和上部烤后烟叶总氮和烟碱含量，这与韩锦峰等［20］和齐群钢等［22-23］的研究结果一致。打顶后施用外源EBR可在不增加施氮量的情况下提高烤后烟叶的烟碱含量，除EBR 可调控烤烟成熟期的氮代谢外，这可能还与EBR 具有提高植物的低温抗性［18，25］和促进生长发育［19，26］等作用有关，尚需进一步试验验证。本研究中还发现叶面喷施EBR处理后烟株氮素的吸收同化、转运和保持能力均优于灌根处理，这可能与本试验中等量的外源EBR 通过叶面喷施（T1）后烟株吸收更直接，吸收量更多，而灌根处理（T2）只有部分被根系吸收利用，导致T1和T2处理外源EBR 进入烟株体内的量不同有关。此外，T1 处理中部叶调控氮素转移和再利用的关键基因NtGS1-3的相对表达量显著低于CK处理，而T2处理则极显著高于CK 处理（图2C），说明两种施用方式对中部叶氮素转移能力的效应不同。与CK 处理相比，T1 处理对烤后烟叶能起到降氯提钾的作用（表4），这与李健忠等［26］和梁鑫等［29］的研究结果一致。T1处理上部叶中钾含量显著提高，这可能与T1处理烟株茎的干物质积累量显著提高（表2）且通过茎向叶片转运的钾增多有关。

本研究中初步证实外源EBR可通过促进烟株的生长发育提高烤烟成熟期氮代谢和烟碱代谢水平，从而增加烟叶烟碱含量，但叶面喷施和灌根外源EBR 对烟株根系、叶片氮代谢和烟碱代谢影响差异的分子机理以及外源EBR对叶片衰老进程的影响等还有待进一步研究。

4 结论

打顶后叶面喷施和灌根两种EBR施用方式均可提升成熟期烟株的光合能力，增加烟株各部位的干物质积累量，提高烟株的氮代谢及烟碱代谢水平，提高叶片中的总氮和烟碱含量，显著提升中部和上部烤后烟叶烟碱含量。其中，叶面喷施处理可分别提高中、上部烤后烟叶烟碱含量14.29%和16.74%，效果优于灌根处理。因此，可以通过叶面喷施0.2 mg/L EBR溶液的方法调节烤烟成熟期的氮代谢和烟碱代谢，提高上部烟叶烟碱含量。