甘草泻心汤治疗溃疡性结肠炎作用机制研究进展

贾文君 杜锦辉

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC),是由免疫介导的慢性及复发性肠道炎症。 UC 的病因及发病机制至今尚未明确,目前普遍认为是遗传、环境、免疫、肠道微生态、黏膜屏障等多种因素的综合作用所致[1]。 现阶段无根治手段,主要以控制炎症,诱导维持临床缓解,促进黏膜愈和、预防并发症为主。中医学没有UC 病名的论述,根据腹痛、腹泻、便血及黏液脓血便等临床特点,将其归属于“泄泻”“久痢”“肠澼”等范畴[2]。 UC 病机复杂,属本虚标实之病。 虚为脾气亏虚,实为湿、热、瘀、毒,气血凝滞[3]。 UC 辨证可分为湿热内蕴证、脾胃虚弱证、脾肾阳虚证、肝郁脾虚证、阴血亏虚证、气滞血瘀证等证型[4],以湿热内蕴证和脾胃虚弱证多见[5-6]。 甘草泻心汤出自于《伤寒论》,主要用于表邪误下损伤脾胃后形成的寒热互结之痞证,出现肠鸣、下利频数,水谷不化、或见干呕等症状[7],与UC 的湿热蕴结、脾胃虚弱的病机相符合。 在中医辨证论治思想的指导下,将甘草泻心汤应用于治疗UC 取得了显著的疗效。 实验研究发现甘草泻心汤治疗UC 具有修复肠道黏膜屏障、调节免疫系统、调节肠道菌群等药理作用。

1 修复肠道黏膜屏障

UC 的发病机制十分复杂,是遗传因素、环境因素、免疫反应、肠道微生物等多种因素相互作用的结果。 环境因素、感染因素作用于遗传易感人群,肠黏膜局部屏障功能受损,肠黏膜屏障通透性增加, 致病菌或肠道正常菌群及其代谢产物侵入肠黏膜上皮, 诱发免疫屏障紊乱[8]。

1.1 促进紧密连接蛋白表达

肠道黏膜屏障主要由肠上皮细胞、肠黏液层、肠道菌群、分泌性免疫球蛋白(secretory immunoglobulin A, sIgA)、肠道相关淋巴组织等共同组成。 UC 的肠黏膜损伤与紧密连接蛋白密切相关,紧密连接蛋白(claudin)是机械屏障最重要的组成部分,其表达的变化反应了肠道机械黏膜屏障的变化。

武晓琳等[9]发现通过免疫组化、蛋白质印迹法和实时 PCR 方法检测恶唑酮诱导的 UC 大鼠claudin-1、claudin-4 mRNA 和蛋白表达,结果显示claudin-1、claudin-4 表达显著下著降低,claudin-2 mRNA 和蛋白表达显著增高,可能是导致肠黏膜机械屏障功能受损的重要机制之一。 陈浩等[10-11]在动物实验中分别予TNBS/乙醇法造模后的UC模型大鼠生理盐水、美沙拉嗪及甘草泻心汤低、中、高剂量灌胃,14 天后发现与给予生理盐水的造模组相比,美沙拉嗪及甘草泻心汤各剂量组结肠组织 claudin-1 蛋白和 mRNA 表达均明显增高(P<0.01),同时改善UC 模型大鼠的症状,以甘草泻心汤中剂量效果明显,表明甘草泻心汤可能通过促进claudin-1 蛋白和mRNA 表达修复肠道黏膜屏障。

肠上皮紧密连接蛋白在肠道黏膜屏障中发挥着细胞间连接的重要作用,UC 通过降低封闭性紧密连接蛋的表达,同时促进渗漏性紧密连接蛋白表达,使肠上皮通透性降低,损伤肠道屏障,claudin 含量随病变加重而波动,可成为判断UC 病情严重程度的指标和潜在的治疗靶点。 实验研究也发现甘草泻心汤可促进claudin-1 蛋白和mRNA 表达,可继续研究甘草泻心汤对紧密连接蛋白复合体的影响,进一步探讨甘草泻心汤修复肠道黏膜屏障的机制。

1.2 促进分泌型免疫球蛋白A 表达

sIgA 主要来源于肠黏膜固有层的浆细胞,主要存在于呼吸道、消化道、泌尿生殖道等黏膜表面,参与局部黏膜免疫,对胃肠道及呼吸道黏膜均具有保护作用,是维持肠道免疫屏障的重要调节因子[12]。

石涛等[13]以免疫组化法检测轻、中、重度UC患者肠黏膜组织的咬合蛋白(occludin)、分泌型免疫球蛋白 A(sIgA)和 β 防御素(β-defensin)的表达,观察肠道机械屏障、免疫屏障和化学屏障功能的变化,发现UC 患者的occludin 和sIgA 在肠道上皮表达下降,随着临床分级增加,肠道机械屏障、化学屏障损伤更加明显。 孙慧怡等[14]通过建立UC 大鼠模型发现与正常组大鼠相比,UC 大鼠结肠及肺组织中s-IgA 表达显著升高(P<0.05),结肠组织中白细胞介素4(interleukin 4,IL-4)表达显著升高(P<0.05)。 郭佳裕等[15]观察甘草泻心汤对抗生素诱导肠道菌群失调小鼠sIgA 表达的影响,发现甘草泻心汤低、中、高剂量组和思连康组均能促进肠道内sIgA 的表达,且甘草泻心汤疗效优于思连康,证实了甘草泻心汤可通过促进肠道sIgA 的表达从而促进肠道黏膜修复。

sIgA 是反应肠道免疫屏障功能的重要指标,现阶段的实验初步证实了在光镜观察下甘草泻心汤对小鼠肠道内sIgA 有一定的促进作用,但目前基于sIgA 变化探究甘草泻心汤对UC 影响的实验,仍需进一步研究。

1.3 减少肠上皮细胞凋亡

近年来研究发现UC 存在结肠黏膜上皮细胞凋亡加速的病理特点,肠上皮细胞过度凋亡导致肠黏膜屏障损伤是引起 UC 发生发展的重要环节之一[16-17]。 沈雁等[18]基于 PERK-elF2α-CHOP 信号通路进行细胞实验和动物实验研究甘草泻心汤保护UC 肠黏膜屏障的机制。 在细胞实验中UC 模型组的细胞存活率(46.88±6.09)% 显著低于正常组(97.16±4.21)%,细胞凋亡率(29.95±2.16)% 显著高于正常组(3.13±0.28)%,甘草泻心汤组的细胞存活率显著上升、凋亡率均显著降低,且G2 期细胞比例均显著升高(P<0.01);甘草泻心汤中、高剂量组蛋白激酶R 样内质网激酶(R-like ER Kinase,PERK)、真核细胞起始因子2α(p-elF2α)、转录活化因子4(the activating transcription factor 4,ATF4)和C/EBP 同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)水平均显著降低(P<0.01)。 在动物实验中甘草泻心汤低、中、高剂量组的损伤指数、结肠上皮凋亡细胞数、血清D-乳酸(D-lactic acid,D-LAC)和二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)含量均显著减少(P<0.05,P<0.01),组织中 p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白和凋亡蛋白Bax 的水平均显著降低(P<0.05,P<0.01),凋亡蛋白Bcl-2 的水平均显著升高(P<0.01)。 证实了甘草泻心汤治疗UC 的部分机制是通过抑制PERK-eIF2α-CHOP 凋亡信号通路的激活,减少肠上皮细胞凋亡、降低肠上皮通透性,保护肠黏膜屏障。

肠上皮细胞是肠道黏膜屏障的主要结构和功能基础,肠上皮细胞发生过度凋亡,引起肠道屏障结构受损,肠上皮通透性增加,外源性致病菌或肠道正常菌群及其代谢产物侵入肠黏膜上皮,引发一系列炎症反应。 体外细胞实验和动物实验均发现UC 存在肠上皮细胞过度凋亡的现象,甘草泻心汤可抑制PERK-eIF2α-CHOP 凋亡信号通路的激活从而控制肠上皮细胞凋亡,但甘草泻心汤是否能够影响其他凋亡通路仍需要继续深入地研究。

2 调节免疫系统

UC 病变主要表现为肠黏膜过度免疫细胞浸润和组织破坏,从侧面反映出免疫因素是UC 发生、发展的关键所在[19-20]。 肠道免疫功能主要依靠黏膜免疫屏障、免疫细胞及免疫分子[21]。 正常情况下,辅助性 T 细胞(help T cell,Th)、抑制性 T 细胞(regulatory T cell,Treg)和细胞毒性T 细胞(cytotoxic T cell,Tc)在肠黏膜中出于平衡状态。 以往认为UC以Th2 介导为主[22],近年来研究发现UC 患者肠黏膜炎症组织中可检测出Th17、Treg 细胞的聚集[23]发挥促炎作用。 白细胞介素(interleukin,IL)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)、干扰素(interferon,IFN)和转化生长因子(transforming growth factor,TGF)等细胞因子分泌失衡也与UC 关系密切。 在肠道中,免疫系统的促炎和修复信号之间的平衡对于维持肠稳态是必不可少的。 相关信号通路的异常激活可释放大量炎性因子、免疫因子、趋化因子,从而引起免疫炎症反应,损伤肠道。 目前已知 TLRs/NF-κB、 IL-6/NF-κB/STAT3、 Th17/Treg等信号通路与UC 相关[24]。

2.1 抑制 TLR4/NF-κB 信号通路

TOLL 样受体(toll-like receptors,TLRs)是固有免疫中关键的模式识别受体,参与非特异性免疫的一类重要蛋白质分子,也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁[25]。 核因子 κB (nuclear factor-κB,NF-κB)是一种核转录因子,调控众多下游细胞因子(尤其是促炎因子)和相关酶类等[26]。 TLR4 与衔接分子髓样分化因子88 (myeloid differentiation factor88,MyD88)相识别,从而激活 NF-κB 下游调节因子,使肠黏膜屏障缺血受损导致肠道细菌、内毒素移位,进而诱导大量炎性因子释放,引发炎症反应[27]。

陈仪等[28-31]应用2,4-二硝基氯苯联合乙酸诱导建立UC 大鼠模型,研究甘草泻心汤干预UC 模型大鼠急性炎症过程和对TLR4/NF-κB 信号通路的调节作用,实验将雄性Wistar 大鼠随机分为空白组、模型组、柳氮磺胺砒啶组、甘草泻心汤高、中、低剂量组,造模后予柳氮磺胺砒啶组和甘草泻心汤各剂量组大鼠药物灌胃治疗,大鼠一般情况、疾病指数、结肠组织黏膜病理形态均较模型组有明显改善,其中甘草泻心汤高剂量组的疾病指数低于柳氮磺胺砒啶组(P<0.05)。 与模型组相比,各治疗组血清IL-1β、 IL-6、 IL-8、 TNF-α 浓 度 低, IL-10 浓 度 高(P<0.05)。 甘草泻心汤高剂量组与柳氮磺胺砒啶组的差异具有统计学意义(P<0.05)。 各治疗组大鼠 结 肠 组 织 TLR4、 MyD88、 NF-κB p65、 I-κB(inhibitor of NF-κB) 蛋白表达水平、TLR4、NF-κB p65、MyD88 mRNA 转录表达水平均显著低于模型组。 王作玉[32]应用葡聚糖硫酸钠(DSS)建立UC 小鼠模型,探究甘草泻心汤对UC 小鼠 TLRs/NF-kB信号转导通路中相关蛋白的影响,发现甘草泻心汤可抑制 TLR4、MyD88 蛋白表达,促进 β-arrestin (抑制蛋白)生成,其中甘草泻心汤高剂量组效果更明显。

2.2 抑制IL-6/STAT3 信号通路

IL-6 与靶细胞表面受体(soluble interleukin-6 receptor,sIL-6R)结合,形成 sIL-6R/IL-6 复合物,活化细胞膜表面的糖蛋白130 (glycoprotein 130,gp130),gp130 受到刺激形成同源二聚体,进一步激活与gp130 相关联的两面神激酶(Janus kinase,JAK), 并与信号转导转录因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)蛋白结合, 使STAT3 磷酸化后激活 NF-κB,发挥促炎作用[33]。 陈浩等[11,34]以TNBS/乙醇法造模UC 大鼠模型,造模成功后分别以生理盐水、美沙拉嗪及甘草泻心汤各剂量予模型组、美沙拉嗪组、甘草泻心汤低、中、高剂量组灌胃,14 天后以免疫组化方法分析结肠组织IL-6、STAT3 及磷酸化 STAT3 的蛋白表达, 以 qPCR法检测结肠组织 IL-6 及STAT3 的 mRNA 表达。 研究甘草泻心汤对UC 模型大鼠的疗效和IL-6/STAT3信号通路中相关分子的调节作用。 结果显示美沙拉嗪组及甘草泻心汤各剂量组UC 模型大鼠结肠组织IL-6、STAT3、磷酸化 STAT3 的蛋白表达明显降低,美沙拉嗪组及甘草泻心汤各剂量组的IL-6 表达无明显差异,中剂量组的STAT3 表达、高剂量组的磷酸化STAT3 显著低于美沙拉嗪组。 各治疗组给药后与模型组比较,IL-6、STAT3 mRNA 表达水平均明显下降(P<0.01),同时发现甘草泻心汤对UC 模型无肝肾毒性,证实了其安全性。

TLRs/NF-κB、IL-6/STAT3 信号通路的活化是UC 发生与发展的重要分子生物学机制,近年来的实验多基于对信号通路的研究探讨甘草泻心汤对UC 的治疗机制,证实了甘草泻心汤可能通过抑制TLR4/NF-κB、IL-6/STAT3 炎症信号通路中相关核心蛋白和基因的表达,抑制信号通路的活化,下调促炎因子、上调抗炎因子,调节免疫系统从而达到治疗UC 的目的。

3 抗氧化应激

氧化应激是机体受到损害时体内氧化与抗氧化作用失衡的一种状态,倾向于氧化,由自由基在体内产生的一种负面作用,氧化应激导致中性粒细胞炎性浸润,蛋白酶分泌增加,产生大量氧化中间产物,从而导致组织损伤,参与并加重了UC 肠道黏膜的损伤和炎症的发生[35]。 陈章风[36]以 DSS 将C57 小鼠复制为UC 病理模型,利用血清酶学和分子生物学方法研究甘草泻心汤治疗UC 的可能机制。 研究发现,造模后小鼠血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)含量明显降低,结肠组织中一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)蛋白含量明显增高,说明UC 结肠组织中自由基形成,抗氧化应激能力下降。 给药后(柳氮磺吡啶、甘草泻心汤)小鼠的血清SOD 含量上升,结肠组织中的iNOS 蛋白表达水平明显下降。 与柳氮磺吡啶相比,甘草泻心汤SOD 含量增加幅度大,差异有统计学意义(P<0.05),iNOS 蛋白表达降低水平的差异无统计学意义(P>0.05)。

iNOS 在正常情况下含量很低,UC 病变过程中形成了大量炎性因子如IL-1、TNF-α 可激活肠组织中的iNOS 蛋白,产生一氧化氮(nitricOxide,NO),从而降低机体内SOD 的含量,SOD 是机体重要的抗氧化酶,具有清楚氧自由基、防止组织损伤的能力,SOD 含量的下降进一步加重UC 疾病程度。 将甘草泻心汤灌胃治疗UC 小鼠发现甘草泻心汤可增加抗氧化能力,发挥协同作用治疗UC。

4 调节肠道菌群

人体肠道微生态可分为宿主共生菌、条件致病菌和病原菌,正常情况下,肠道各类菌群与机体互利共生,构成肠黏膜屏障的生物屏障,对外来菌株有定植抵抗作用。 饮食、环境等致病因素作用于机体后,肠道菌群的稳定性遭到破坏,肠道定植抵抗力大为降低,可导致肠道中潜在性病原体(包括条件致病菌)的定植和入侵,引起各种疾病。 余今菁等[37]通过高通量测序技术检测UC 患者肠道菌群发现UC 患者肠道菌群多样性、构成及丰度与健康对照人群比较存在显著差异,UC 患者肠道菌群结构明显失衡。 邱春雷等[38]在临床试验中发现活动期UC 和缓解期UC 患者双歧杆菌、乳酸杆菌、拟杆菌、球形梭菌、柔嫩梭菌、普拉梭菌及总细菌菌落数均减少,大肠埃希菌、肠球菌菌落数增加;以活动期UC 肠道菌群改变明显(P<0.05)。 叶佳等[39]研究UC 患者肠道菌群与Th17、Treg 相关性发现,肠道菌群失调可影响Th17/Treg 免疫平衡,调节炎性因子分泌,从而影响UC 发病。 马晓田、孟娟等[40-41]利用16SrDNA 扩增子测序的方法检测甘草泻心汤治疗14 日后的小鼠肠道菌群多样性,发现甘草泻心汤甘草泻心汤中剂量组的物种丰度(双歧杆菌、乳酸杆菌OTUs 序列数目)明显高于模型组、高剂量组、低剂量组及思连康组,大肠埃希菌、肠球菌的数量明显低于模型组、思连康组。 在样本内多样性分析中,甘草泻心汤中剂量组Shannon 指数高于高剂量组、低剂量组、思连康组、模型组。 说明甘草泻心汤可改善提高菌群物种丰度,改善肠道菌群多样性。

肠道菌群作为肠道黏膜生物屏障在防御肠道疾病上发挥着重要作用,肠道正常菌减少、致病菌增加,菌群多样性降低会破坏UC 患者免疫系统的平衡,同时加重UC 肠道黏膜的损伤,增加疾病严重程度,改善肠道菌群结构、增加肠道菌群丰度是治疗UC 的重要治疗方案。 动物实验证实甘草泻心汤可调节肠道菌群,在临床上除应用益生菌,也可应用甘草泻心汤治疗UC 患者肠道菌群失衡。

5 总结与展望

UC 是炎症性肠病最常见的疾病类型之一,自发现以来多见于欧美国家,近年来我国的内镜检出病例数有逐渐增加的趋势。 UC 起病多隐匿,呈发作期和缓解期相互交替的慢性过程,目前临床上多应用5-氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫抑制剂、生物制剂、联合益生菌等药物治疗和干细胞移植、粪菌移植、心理干预等非药物治疗方法相结合的治疗方法,但难以取得满意疗效。 中医药作为中华文明的瑰宝,虽未明确提出UC 病名的论述,但早在内经时期就对其病因病机、临床表现做了相关解说。 东汉时期,医圣张仲景在《伤寒论》更是提出应用辛开苦降之甘草泻心汤治疗UC 的方法。 到了现代,大量的临床实验结果证实了甘草泻心汤治疗UC 的有效性。 为进一步指导临床治疗UC,近年来的实验在分子生物层面深入探究甘草泻心汤治疗UC 的作用机制,未来需要从UC 其他发病机制考虑,继续研究甘草泻心汤治疗UC 的机制,也需要对机制研究实验进行系统评价,以明确其有效性,为临床治疗UC 提供实验依据。